香草提取物和植物精油增强茶树抗逆能力的效应

李荣林，唐 君，艾仄宜，穆 兵，杨亦扬，陈正涛，史海华

（1江苏省农业科学院休闲农业研究所，南京 210014；2江苏省溧阳市玉莲生态农业有限公司，江苏溧阳 213333）

0 引言

抗逆能力的发生是植物适应环境延续生存的一种策略，无论是遭受病虫侵袭还是应对机械损伤、气候、土壤的变化，植物都会自主产生适应性反应，这些反应包括酶系统的变化，代谢物质合成的变化以及对逆境引起的机体自由基的清除能力。例如大多数植物受到昆虫取食时损伤部位会发生褐变反应，这是由于损伤部位多酚含量上升、多酚氧化酶或过氧化物酶活性升高的结果[1]。在作物栽培管理中，采用适当的技术提高作物的抗逆能力是提高作物产量和品质的重要手段之一。

很多植物的提取物被开发成生物农药，这是利用这些提取物中的成分对害虫或病原菌的直接杀伤作用，植物精油的抑菌机制是挥发性成分渗入病原物细胞引起细胞破裂或死亡，芳香植物挥发物对害虫及其天敌的作用主要是通过气味反应来实现，已有很多证据显示芳香植物的挥发物可用于调节害虫或天敌的行为，因而用于植物的生态防护[2]。芳香植物或香辛植物提取物施用于作物后也可以引起作物酶系统发生直接变化，从而对植物生理活动产生调节，细辛、苦参、蛇床子的提取物不仅对茄子黄萎病病原菌产生直接抑制，而且在一定浓度范围(1～4 mg/L)茄子POD和PAL、SOD活性均表现出随提取物浓度的升高而升高的趋势，这些指标的升高能提高植株抗逆性[3-4]，100 mg/L的香樟叶石油醚提取物能直接抑菌并显著提高草莓果实PAL、PPO和POD的活性，增强果实自身的抗真菌病害能力[5]。

以植物中特定成分为基础仿生合成的外源物质同样能够诱导植物特定酶系统的变化，进而在代谢上和生理上产生响应。β-氨基丁酸(BABA)，茉莉酸或茉莉酸酯(JA，MJA)，水杨酸或水杨酸酯(SA，MSA)，苯并噻二唑(BTH)可以诱导植物抗病或抗虫[6-7]。源于芳香植物或茶树本身的特定物质外源施用也可以诱导茶树发生复杂的生理反应。在茶树上施用青叶醇、罗勒烯、法尼烯、橙花醇等物质可以诱导茶树挥发物的发生量和组成的显著变化，并发挥更多的生理或生态调节功能[8-9]。水杨酸或水杨酸甲酯(SA，MSA)能显著提高茶树对盐胁迫的防御能力[10]。

茶园间作芳香植物以达到遮荫、改良土壤、防御病虫害的研究已有报道[11]，但芳香植物提取物对茶树抗逆生理的影响研究较少。本试验选择迷迭香、薄荷、紫苏等较为常见易于生长亦适合茶园间作的香草植物，探讨它们的复合提取物对茶树生理的影响。同时选择冬青油（主要成分水杨酸甲酯）、二氢茉莉酸酯（茉莉酸甲酯衍生物）做参照一并进行试验。

1 材料与方法

1.1 设备

Eppendorf 5702离心机（德国Eppendorf仪器有限公司），759S紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司），Light Cycler 480 II实时荧光定量PCR仪（瑞士Roche group）。

1.2 植物提取物

迷迭香、紫苏、猫薄荷新鲜叶片液氮磨碎，叶片水分按75%计算，然后以干重计按料液比1:10在75%工业乙醇中浸提72 h,浸提完毕4层纱布过滤得植物粗提液，-20℃保存。

冬青油（水杨酸甲酯≥99.2%），二氢茉莉酸酯（茉莉酸酯衍生物，二氢茉莉酸酯≥99%）购于江西吉安红星香料有限公司，预先以75%乙醇稀释至1%(V/V)作为贮备液，-20℃保存。

1.3 供试茶树

南京中山陵茶场，黄山种，15年生。

1.4 试验处理

冬青油、二氢茉莉酸酯贮备液用水稀释至0.1%(V/V)。迷迭香、紫苏、猫薄荷粗提液用水稀释100倍(V/V)，于12月初选择晴天均匀喷洒于茶树上，每种物质处理重复3次，每个处理茶行之间间隔2行，试验区茶行长度10 m，喷液量1 L，对照用液为将75%工业乙醇用水稀释1000倍(V/V)所得。喷液24 h后采集1芽2～3叶或同等嫩度对夹叶，立即投入液氮，然后-80℃保存，供测试用。

1.5 茶树叶片酶活性测定

参考文献[12-13]方法，结合本实验室的经验加以调整。

1.5.1 酶提取 取约1.0 g样品放入研钵，加1 g交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，少量石英砂，加预冷的磷酸缓冲液(PBS)3～5 mL，多酚氧化酶(PPO)提取时用pH 6.5的PBS，苯丙氨酸解氨酶(PAL)、脂氧合酶(LOX)和超氧化物歧化酶(CAT)提取时用pH 8.0的PBS研磨，然后4℃，6000 g离心15 min，上清液以水定容至25 mL作为酶储备液。

1.5.2 多酚氧化酶活性测定 用邻苯二酚比色法，定义每克样品吸光度每分钟变化0.1为1个酶活力单位。底物：pH 6.5的PBS与0.1%脯氨酸及1%邻苯二酚按10:2:3的体积比均匀混合。酶活性计算见式(1)。

式中：AX-酶反应液吸光度，A0-空白吸光度，V1-测定酶活时取用酶液体积，V2-酶提取液总体积，t-酶反应时间(min)，W-酶提取所用鲜叶样品质量(g)。

1.5.3 苯丙氨酸解氨酶活性测定 用290 nm紫外法，每克样品每分钟吸光度变化0.01为1个酶活力单位。底物：20 mmol/L苯丙氨酸溶液。

酶活性计算同1.5.2。

1.5.4 脂氧合酶(LOX)活性测定 每克样品每分钟吸光度变化0.01为1个酶活单位。

底物：亚油酸钠与Tween20按1:1.1(M/M)比例均匀混合，再用pH 8.7硼酸缓冲液溶解，以0.1 mol/L盐酸溶液调至pH 6.5，使溶液澄清，亚油酸钠浓度10 mmol/L。

酶活性计算同1.5.2公式(1)。

1.5.5 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定 用NBT光还原法，以NBT光氧化抑制率50%为1个酶活单位。

底物：130 mmol/L甲硫氨酸，750 μmol/L氮蓝四唑，20 μmol/L核黄素等体积混合。SOD酶活性计算见式(2)。

式中：AX-酶反应液吸光度，A0-空白吸光度，V1-测定酶活时取用酶液体积(mL)，V2-酶提取液总体积(mL)，W-酶提取所用鲜叶样品质量(g)。

1.5.6 叶片基本代谢成分分析 多酚总量用Folin-Ciocalteu’s法(GB/T8313—2018)，黄酮总量用三氯化铝比色法[12]，可溶糖测定用蒽酮比色法[12]，氨基酸总量用茚三酮比色法(GB/T8313—2013)。丙二醛测定用硫代巴比妥(TBA)法[13]，木质素测定用尿素-氢氧化钠法[14]。

1.5.7 自由基清除试验 1 g新鲜叶片，用75%乙醇按1:10(M/V)物料比提取24 h,5000 g离心，取上清液，用水定容至50 mL,再稀释10倍，用于测试试验处理茶树的叶片提取物对活性氧的清除能力。超氧自由基(O2·)由水杨酸反应体系产生，羟自由基(OH·)由Fenton反应体系产生[15]。

1.5.8 CsOPB3基因表达测试[16]参考文献[16]的方法。总RNA提取用RNA分离试剂盒(Invitrogen,CA,USA)按使用说明书步骤进行，定量PCR分析在96孔板中进行，反应程序：起始95℃2 min，95℃变性10 s，退火与扩增58℃30 s。

2 结果与分析

表1数据显示，植物提取物和仿生合成香精油处理茶树叶片多酚含量相对提高3.93%～24.2%，木质素含量相对提高5.8%～16.53%，氨基酸含量相对提高27.8%～55.6%。除薄荷提取物处理外，其他处理叶片丙二醛含量降低9.2%～32.8%。

表1 叶片中代谢物含量

酶活性分析结果（表2），各试验处理多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、脂氧合酶(LOX)活性都有明显升高，多酚氧化酶活性升高幅度1.89～4.35倍，超氧化物歧化酶活性升高1.98～10.4倍，脂氧合酶(LOX)活性升高1.41～2.58倍，紫苏、迷迭香提取物处理可使苯丙解氨酶(PAL)活性明显提高，其余处理PAL呈下降趋势。

表2 茶树叶片酶活性(U）

植物精油或香草提取物处理后的茶树鲜叶（表3），其乙醇提取物对超氧自由基的清除能力提高1.3～2.9倍。对羟自由基的清除效率除薄荷处理外都稍有提高，冬清油处理比对照略低，但差异不显著。

表3 茶树叶片提取物活性氧清除效率 %

二氢茉莉酸酯、迷迭香、紫苏提取物处理后茉莉酸信号途径关键基因(CsOPB3)表达上调明显，薄荷处理变化不明显，冬青油处理略有下降（见图1）。

图1 CsOPB3基因表达分析

3 讨论与结论

逆境(stress)是指对植物生存或生长不利的环境因子，也称胁迫。环境胁迫可分为生物胁迫(bioticstress)（如病害、虫害、杂草等）和非生物胁迫(abioticstress)（如辐射、高温、低温、干旱、盐害、大气污染等）[1]，提高作物对逆境的防御或适应能力是作物栽培管理的重要环节。

笔者在前期工作中已经发现一些生物刺激素能够很好地调动茶树对逆境的生理响应[17]，本研究中进一步发现芳香植物提取物和仿生生物活性物质同样具有提升植物抗逆境能力的潜在效能。

氨基酸是植物体内重要的基础生化成分，在植物生长生理活动中直接发挥关键性作用，因而是反应植物抗逆能力的重要指标，氨基酸含量升高对增强植物的抗逆境能力有利，相反丙二醛是脂质氧化产物，在逆境条件下，植物体内丙二醛含量通常会显著增加[1]。本试验中，各处理都可诱导氨基酸的升高，因而具有提升茶树抗逆能力的潜能。而除薄荷处理外，其余各组丙二醛含量都发生下降，提示茶树细胞所受胁迫有所减轻。

次生代谢物质如酚类、黄酮类、萜类、生物碱合成主要通过苯丙烷类代谢途径进行，苯丙氨酸解氨酶(PAL)是这一途径的关键酶之一。一些文献认为PAL活性可以作衡量植物抗逆性强弱的指标之一[20-21]，但在本试验中，PAL活性的变化趋势与多酚类含量的变化趋势并不一致，这一现象在以前的试验中也有发现[17]。这是因为酚类物质生物合成在PAL催化反应之后还有很多的分支途径，PAL可能是影响多酚积累的重要因素，但后续过程也会发生重要影响。另外，虽然PAL活性升高有利于酚的累积，但酚类含量升高也可能对PAL产生反馈抑制，这个过程也涉及到众多的调控因子。笔者尝试分析PAL与黄酮之间的对应关系，PAL活性处于第2位，第3位的处理对应黄酮含量在第1和第2位，但PAL活性最高的紫苏处理组，黄酮含量处于第4位，相关性也没有很明显。PAL家族有众多的同工酶，有可能总的酶活性不能全面反映酚类的次级代谢状态，这问题需要进一步研究[22]。

多酚能够吸收逆境反应过程产生的自由基，能够防止UV辐射和自由基引起的损伤，中止自由基引发的链锁反应，从而阻止氧化的继续进行，这在许多植物上都已得到证明[18,23]，植物体内多酚含量适度提高对缓解氧化胁迫有利，本试验各处理均能使叶片多酚含量适当提高，这是有益的。木质素是与多酚关系密切的高聚物。木质素可与纤维素、蛋白等结合成复杂的不溶性聚合物，形成物理屏障阻隔病原菌侵染和扩散，或阻碍害虫取食[18-19]。本试验显示3种香草提取物冬季处理茶树木质素含量提高了5.8%～16.53%，不过冬青油（水杨酸酯）和二氢茉莉酸酯处理下木质素却呈现下降趋势，如果是在春季，冬青油和二氢茉莉酸酯处理也能引起木质素下调，则对保持茶树新梢持嫩性有利[24]。

多酚氧化酶(PPO)是多酚转化的关键酶，在植物防御逆境胁迫中与多酚协同发挥重要作用，多酚氧化酶活性升高，催化较多的酚类物质氧化生成醌类，并进一步生成黑色素，可防止病原菌扩散或阻止草食动物取食[25-26]。茉莉酸信号可能参与PPO活性的调节[26-27]。

脂氧合酶(LOX)在植物的生长发育、胁迫应答等诸多过程中都具有广泛的作用，植物在生长过程中遭遇机械伤害、干旱、病原菌侵染、紫外线辐射等逆境压力时，都能诱导LOX基因的表达[28]。LOX还能促进香气物质醛和醇的合成与释放，LOX参与的茉莉酸合成的丙二烯氧化合酶(AOS)途径是脂肪酸代谢的主要分支路径之一，并可能与萜类的形成有关。这些挥发物质不仅是茶叶品质形成的关键，也是重要的生态调节因子，邻近植株通过感受到近邻茶树因遭受环境胁迫而释放的挥发物，可及时产生相应的预警反应，提高对逆境胁迫的适应能力。因此提高LOX活性是增强植物抗逆能力的重要途径[29]。本试验中除冬青油处理下脂氧合酶(LOX)活性微有下降，其余各组脂氧合酶(LOX)活性升高了1.41～2.58倍，因此可以认为用香草植物提取物处理茶树对于提高茶树的综合抗逆能力是有益的。

本研究所用的6种不同供试物质在处理茶树后，SOD酶活性均有显著提高。SOD在活性氧清除反应中有重要意义[30]，从超氧自由基和羟自由基的清除效率看，香草植物处理确实能发挥一定作用。

茉莉酸(JA,MJA)或水杨酸(SA,MSA)不仅是植物绿叶挥发物的重要组分，还是重要的信号物质。外源MJA可减轻干旱胁迫下的生理伤害，促进β萝卜素的积累，保护其他质体色素免受氧化降解，增强植物的免疫能力[31]。外源MSA或MJA处理茶树可提高茶树抗虫能力，耐盐能力和抗低温能力[32-33]。本试验条件下二氢茉莉酸酯也可以产生很好的生理调节效应，工业上二氢茉莉酸酯比茉莉酸酯廉价易得，更有利于在农业上应用。内源茉莉酸(JA)或茉莉酸酯(MJA)是植物响应机械伤害、病虫害、低温以及盐胁迫等逆境的重要信号物质，损伤通过机械刺激产生特定信号，并经茉莉酸途径进行传导激活相应的反应。外源茉莉酸或水杨酸对植物发挥作用一般要通过内源茉莉酸信号的调节来完成，茉莉酸信号途径关键基因(CsOPB3)对内源茉莉酸合成有直接影响[34-35]，二氢茉莉酸酯、迷迭香、紫苏提取物处理后表达上调明显，这可能有利于JA或MJA的积累，并产生更多的生理效应，冬青油处理下CsOPB3表达略有下降，这可能是因为SA与JA在植物体内存在拮抗效应[36]。

消除植物体内过剩的活性氧，降低膜脂质过氧化水平是减轻环境胁迫对植物伤害的重要途径。有研究认为2，4-表油菜素内酯、外源MJA等可以通过消除活性氧解除高温或低温胁迫下水稻的应急状态[35,37]。本试验指出植物精油或香草提取物处理后的茶树鲜叶，其水提取物对超氧自由基的清除能力提高1.3～2.9倍，但对羟自由基的清除效应的提高不明显，如欲经此途径进一步提高茶树的抗逆能力，仍需对所用提取物的使用浓度、使用方法做广泛探讨，并扩大筛选范围。

芳香植物间作改善生态循环的功能在茶园以及其他作物系统中都已得到证明[11,38]，芳香植物提取物直接用于作物病虫害的防治也已广泛研究[39-40]，芳香植物提取物还可以改善植物的代谢，尤其是刺激植物释放更多的挥发物，植物通过挥发性物质直接防御食叶动物和病原菌的侵害，还可以作为信号物质通过植物激素信号途径在同株未受损组织器官或邻近植物中引发防御反应，这种逆境响应的利用对环境更加安全、短时有效[38,40]。

综合代谢物分析、酶活性分析和活性氧清除能力等几方面的结果，本试验中每一种处理下均有2～3个以上与提高茶树抗逆能力有正相关性的指标有显著上升趋势，因此可以认为这些物质尤其是香草植物的提取物有可能被用来缓解茶树所受的环境胁迫。