葡萄阿萨伊果混合饮料对脂多糖诱导斑马鱼炎症模型的保护作用

扈晓佳， 董思萱

(自然阳光(上海)日用品有限公司， 上海 200070)

葡萄(Vitisvinifera)是世界上栽培面积最广的果树作物，也是一种经济价值极高的作物。葡萄富含矿物质、维生素及人体所需的氨基酸，随着生物科技的发展，从葡萄中还相继发现了多种具有抗氧化、消炎的天然活性物质，如白藜芦醇、齐墩果酸、花色苷和原花青素等，具有极高的保健价值[1]。阿萨伊果又称巴西莓，是产于亚马逊雨林地区的一种棕榈树的果实，于2013年被卫生部批准为新资源食品[2-4]。阿萨伊果含有的原花青素二聚体成分，能有效地抑制胰脂活性酶的活性，对人体具有降血脂的功效，帮助人体预防心脑血管疾病[5]。葡萄阿萨伊果混合饮料是自然阳光旗下的天然健康饮品，饮料中的水果精华萃取于阿萨伊果、白葡萄、红葡萄、蓝莓、蔓越莓等水果，含有人体健康所需的花青素、不饱和脂肪酸、氨基酸、维生素、矿物质等营养物质。其主要功能物质包含花青素及原花青素糖苷类、黄酮类物质[6-8]，具有抗菌、抗氧化、消炎、抗疲劳、保护肝脏等多种药理作用[9-11]。目前对葡萄阿萨伊果混合饮料抗炎活性的研究报道仍较少。

斑马鱼作为一种新的模式动物，具有体积小、费用低、实验周期短的特点[12]。目前在食品、活性部位筛选、安全性评价以及药物代谢等中药相关实验中应用广泛。脂多糖(LPS)是所有革兰氏阴性菌的主要外膜成分，可激活中性粒细胞、巨噬细胞和内皮细胞等多种免疫细胞。斑马鱼受到LPS刺激后，启动一系列细胞内信号级联反应，最终导致中性粒细胞活化并释放促炎细胞因子[13-15]。本实验采用脂多糖诱导法构建斑马鱼炎症模型，研究葡萄阿萨伊果混合饮料的最大检测浓度及抗炎活性评价，以期为葡萄阿萨伊果混合饮料的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

受精后3 d的转基因中性粒细胞荧光斑马鱼450尾，由杭州环特生物科技股份有限公司养育中心(实验动物使用许可证号为SYXK(浙)2021-0171)繁殖提供。葡萄阿萨伊果混合饮料由自然阳光(上海)日用品有限公司提供。吲哚美辛(批号：1108939)购自上海晶纯实业有限公司。LPS(批号：12180309)购自Sigma公司。

解剖显微镜(SZX7，OLYMPUS，日本)，CCD相机(VertA1，上海土森视觉科技有限公司)，精密电子天平(CP214，OHAUS，美国)，电动聚焦连续变倍荧光显微镜(AZ100，Nikon，日本)，甲基纤维素(Sigma，美国)，6孔板(Nest Biotech)。

1.2 方法

1.2.1 葡萄阿萨伊果混合饮料最大检测浓度

将6孔板中330尾转基因中性粒细胞荧光斑马鱼随机分为11组，包括正常对照组、模型对照组、9个不同浓度葡萄阿萨伊果混合饮料实验组，每组30尾。正常对照组为养育用水处理斑马鱼，模型对照组和实验组则为用LPS以卵黄囊注射方式处理斑马鱼，建立斑马鱼炎症模型。模型建立成功后，实验组给予系列浓度(3.9、7.8、15.6、31.25、62.5、125、250、500和1 000 μL·mL-1)的葡萄阿萨伊果混合饮料，置于28 ℃培养箱中培养3 h后，考察葡萄阿萨伊果混合饮料不同浓度组的斑马鱼的死亡数量，确定葡萄阿萨伊果混合饮料最大检测浓度。

1.2.2 葡萄阿萨伊果混合饮料的抗炎作用

将6孔板中120尾斑马鱼随机分为4组，包括正常对照组、模型对照组、吲哚美辛组和葡萄阿萨伊果混合饮料组，每孔每组30尾。模型建立成功后，阳性对照组给予80 μmol·L-1的吲哚美辛，实验组给予15.6 μL·mL-1的葡萄阿萨伊果混合饮料。将各组斑马鱼置于28 ℃培养箱中培养3 h后，每组随机选取10尾斑马鱼在荧光显微镜下观察并拍照，计算斑马鱼炎症中性粒细胞个数。以斑马鱼炎症中性粒细胞个数评价葡萄阿萨伊果混合饮料对LPS诱发斑马鱼模型的抗炎活性。

2 结果与分析

2.1 葡萄阿萨伊果混合饮料最大耐受剂量的确定

在进行功效评价之前，考察斑马鱼对不同浓度的葡萄阿萨伊果混合饮料的最大耐受剂量。葡萄阿萨伊果混合饮料在3.9～15.6 μL·mL-1浓度时，斑马鱼无死亡现象，也无明显形态行为异常和毒副作用。在31.25 μL·mL-1浓度时，6.67%(2/30尾)斑马鱼被诱发心包水肿，10%(3/30尾)斑马鱼出现身体弯曲现象。在62.5～1 000 μL·mL-1浓度范围内，葡萄阿萨伊果混合饮料诱发100%(30/30尾)斑马鱼死亡。因此，后续的功效评价中，葡萄阿萨伊果混合饮料的最佳实验浓度确定为15.6 μL·mL-1(表1)。

表1 斑马鱼对不同浓度葡萄阿萨伊果混合饮料的耐受情况

2.2 葡萄阿萨伊果混合饮料抗炎作用评价

葡萄阿萨伊果混合饮料对中性粒细胞在斑马鱼尾鳍伤口处聚集的影响如图1和表2所示。模型对照组斑马鱼炎症部位中性粒细胞个数(16)与正常对照组(3)相比显著上升，而吲哚美辛组(80 μmol·L-1吲哚美辛)斑马鱼中性粒细胞个数与模型对照组比较显著下降(图2)，表明LPS诱发转基因中性粒细胞炎症模型构建成功，同时也说明阳性药吲哚美辛对斑马鱼中性粒细胞的聚集有显著的抑制作用。葡萄阿萨伊果混合饮料浓度为15.6 μL·mL-1时，所对应的斑马鱼尾鳍部位中性粒细胞个数为9，与模型对照组的细胞个数(16)相比显著减少，炎症消退作用为44%，略优于阳性药吲哚美辛组(38%)(图3)。

***表示与模型对照组相比P<0.001。图3 同。

图3 葡萄阿萨伊果混合饮料组与吲哚美辛组对斑马鱼炎症消退作用比较

表2 葡萄阿萨伊果混合饮料对斑马鱼的炎症保护作用

图1 各组斑马鱼炎症部位中性粒细胞聚集情况(红色区域为炎症部位中性粒细胞)

3 小结与结论

炎症是机体对外来生物的一系列综合生理反应，包括人类病原体、灰尘颗粒和病毒等，是机体清除病原体和组织修复的一部分[16]。当炎症发生时会产生各种炎症介质，包括趋化因子、细胞因子、血管活性胺、类二十烷酸和蛋白水解级联产物，从而在局部引发炎症渗出物[17]。此时，血管中的血浆蛋白和白细胞(主要是中性粒细胞)可以通过毛细血管后小静脉进入血管外组织，向炎症部位迁移和聚集[18]，当它们到达受影响的组织部位时，中性粒细胞通过与病原体的直接接触或通过组织驻留细胞分泌的细胞因子的作用而被激活[19]。激活的中性粒细胞试图通过释放有毒成分来杀死病原体，这些成分包括活性氧和蛋白酶3、组织蛋白酶G和弹性蛋白酶[20]。研究表明，机体内的病理过程大多与ROS的过量产生有关，诱导细胞损伤或炎症发生[21]。因此，中性粒细胞个数增多表明炎症反应和炎症浸润的发生，是评价药物抗炎作用的重要指标[22]。

有研究表明，葡萄和阿萨伊果中含有多种抗氧化成分，如花青素、黄酮和酚类成分，具有抗炎、抗氧化、抗高血压和降糖降脂等多种生物活性[23-27]。Kim等[28]使用阿萨伊果提取物处理LPS诱导的炎症细胞，发现阿萨伊果可以抑制IL-6、IL-8和PGE 2等细胞因子表达，从而控制炎症反应。Kang等[29]从阿萨伊果中分离了5种黄酮类化合物，发现其具有抑制NF-kB活化的抗炎作用。Carey等[30]通过体内实验表明，阿萨伊果干预后可以降低大鼠体内BV-2小胶质细胞一氧化氮和肿瘤坏死因子-α的表达。体外实验显示，阿萨伊果可以抑制LPS诱导的炎症反应，其机制可能与抑制一氧化氮合成、抑制NF-kB有关[28]。

斑马鱼因其体积小、繁殖力高和基因组注释完整等优势，成为最受重视的脊椎动物发育生物学模式动物之一，也是目前唯一适合进行微孔板高通量药物筛选的脊椎类动物[31]。斑马鱼幼虫的透明度允许炎症细胞迁移的实时可视化，在炎症反应发生时，斑马鱼的主要白细胞是中性粒细胞，它们是最丰富的，也是最先到达受伤部位的细胞[32]。因此，本实验采用了转基因中性粒细胞荧光斑马鱼，可在荧光显微镜下观察斑马鱼体内的中性粒细胞个数，直观展示斑马鱼体内的炎症反应。

本研究基于LPS诱导的转基因中性粒细胞斑马鱼炎症模型，发现15.6 μL·mL-1自然阳光葡萄阿萨伊果混合饮料对斑马鱼无明显毒副作用，同时可以抑制LPS诱导的中性粒细胞浸润，发挥抗炎作用。结果显示，斑马鱼模型中自然阳光葡萄阿萨伊果混合饮料组的炎症应激反应较模型组显著降低，效果略优于阳性对照组。本研究通过斑马鱼炎症模型验证了葡萄阿萨伊果混合饮料的抗炎活性，为葡萄阿萨伊果混合饮料的研究和应用提供理论基础和实验依据。