3种单剂型除草剂对糯玉米制种田杂草的防除效果及杂草解毒机制的研究

权晓康， 陆宏园， 刘家丰， 丁焓赟， 宋博文， 剧佳华， 胡伟民*

(1.浙江大学 农业与生物技术学院，浙江 杭州 310058； 2.浙江大学 农业试验站，浙江 杭州 310058)

玉米是世界三大粮食作物之一，同时也是中国第一大粮食作物。杂草的影响是玉米生产和制种上必然存在同时危害较大的因素之一。一般在自然情况下，杂草会使玉米减产20%～30%，严重的可达40%以上[1]。全球范围内主要通过使用除草剂来实现田间杂草的防除，但每年都有由于除草剂使用不当而造成玉米减产的情况发生[2]。玉米是杂交优势明显的作物，其亲本自交系由于基因型相对纯合，对生境的敏感度较大，生长势一般劣于杂交种，其中又以甜、糯玉米自交系的敏感性更高，如果除草剂施用不当，极易造成自交系幼苗黄化、根数减少或异常，特别是在干旱缺水的情况下影响更大，黄苗和死苗数明显增加。因此，选择合适的除草剂及正确的施用剂量和时间是当前甜、糯玉米生产特别是制种上需要解决的问题，而目前有关除草剂对甜、糯玉米自交系种子萌发及出苗状况影响的研究报道较少。

酰胺类、三氮苯类、硝基苯胺类除草剂是目前玉米田常用的3类除草剂，代表性单剂型除草剂分别为乙草胺、莠去津和二甲戊灵等，其作用机理和杀草谱有较大差异，并以此为基础混配成了许多复剂，在生产上广泛使用[3]。目前，一些商品化除草剂的作用机理还没有被完全解释，但是过去近40 a使用的除草剂中超过60%的化合物影响叶绿体的功能[4-5]。叶绿体中4个重要的除草剂靶标部位在除草剂分子设计和抗除草剂农作物育种基因工程中受到广泛的重视，这4个重要的除草剂靶标为光合色素及相关组分的合成和代谢、氨的代谢及氨基酸的生物合成、脂类的生物合成及光合电子传递系统[6-7]；此外，除草剂对植物细胞的细胞壁也有着较大的影响[8]。而选择性除草剂杀死杂草的主要原因是利用形态学的不同(如苯氧乙酸类除草剂)或生理上的差异(如敌稗)，也可以利用时差(如除草剂5-氯酚钠)和位差(如除草醚)来达到除去杂草的目的[9-10]。

本文选用玉米大田生产上播后苗前常用的乙草胺、莠去津和二甲戊灵等3类单一剂型除草剂，在糯玉米制种田进行比较试验，研究除草剂防除杂草的效果及对杂草生理生化等指标的影响，从单剂型角度探究不同除草剂对杂草的抑制表现及杂草对除草剂的拮抗机制，同时分析除草剂对自交系种子出苗和幼苗生长的影响，为糯玉米制种和自交系繁种田除草剂的选用提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 参试糯玉米自交系及试验用除草剂品种

1.1.1 参试糯玉米自交系

参试糯玉米制种亲本为浙江大学选育的4个自交系，组合1：母本N27112，父本N67111；组合2：母本N329232，父本N203312。

1.1.2 供试除草剂

供试的除草剂为目前玉米大田生产上常用的播后苗前除草剂，分别为50%乙草胺、38%莠去津、0.33 g·mL-1二甲戊灵等3种除草剂，每667 m2喷施剂量分别为100 g、90 g和180 mL，以等量清水为对照(CK)。

1.2 玉米制种田种植及除草剂防效试验

实验田位于浙江大学紫金港校区农业试验站，田块肥力均匀，地势平坦。播种前对种植的田块进行人工除草，以避免田块杂草的本底影响。除草剂的喷施浓度按每667 m2各类除草剂用量兑水45 L设定，以清水为对照。试验采用完全随机区组设计，父母本行分别划分小区，小区畦面宽0.9 m、长9 m，均匀单粒点播100粒种子，3次重复。2016年4月上旬选择晴朗的天气播种，播种后当天土壤表面喷施除草剂，施药时间为16：00后，施药后覆盖地膜以防雨天影响，5 d后除去地膜。同时，为了避免或减少其他化学物质对试验过程的干扰和影响，在种子萌发和幼苗生长过程中不喷施其他农药。播种后20 d，统计田间出苗情况，测量苗高。

1.3 田间杂草发生情况观察及农艺性状统计

在喷施除草剂后，随机截取小区中段3.6 m2进行连续跟踪观察，观察时间为喷药后20、30和40 d，共3次；分别统计杂草的种类及数目。在40 d，统计不同处理小区均有存活的主要类型杂草的农艺性状，包括叶片数、高度、分枝数等。

1.4 光合作用及相对叶绿素含量的测定

使用SPAD-502叶绿素仪测定不同种类、不同处理杂草叶片的相对叶绿素含量；使用Li-6400光合作用测定仪(PAR=1 000 μmol·m-2·s-1，处理温度20 ℃)测定杂草叶片净光合速率。

1.5 还原型谷胱甘肽(GSH)及谷胱甘肽硫-转移酶(GST)活性的测定

1.5.1 GSH的含量测定

用硫酸缓冲液配制0.5 mg·mL-1GSH母液，分别取0、5、25、50、100、150、200、250 μL，各加入5%三氯乙酸(TCA)5 mL，分别向配好的系列标准液加入适量2-硝基苯甲酸(DTNB)显色，20 ℃水浴5 min使其充分显色，在412 nm下测定D值，绘制标准曲线[11]。

分别取样品0.2 g，加入5 mL 5% TCA，在0～4 ℃下研磨，放入离心管中离心20 min(15 000g)，取部分离心后的上清液放入试管，加入pH 8.0磷酸缓冲液5 mL，再加入DTNB显色，然后在412 nm下测定D值，通过标准曲线获得GSH浓度。

1.5.2 GST活性测定

参照郭玉莲等[12]方法，分别取不同处理叶片各0.2 g，加入5 mL GST酶提取液及磷酸钾缓冲液(pH 6.5)在0～4 ℃下研磨，15 000g离心20 min，上清液为待测酶液。

取2.5 mL 3.0 mmol·L-1GSH，加入0.05 mL上述待测酶液，最后加入0.45 mL溶于96%乙醇的CDNB，340 nm反应5 min，通过计算机测定每分钟光吸收的变化值，并通过以下公式计算GST活性。

GST活力(nmol·min-1)=(ΔD340V)/(εL)。式中ΔD340为每分钟光吸收的变化值，V为酶促反应体积(3.0 mL)，ε为产物的消光系数(0.009 6 L·μmol-1·cm-1)，L为比色杯的光程(1 cm)。

2 结果与分析

2.1 除草剂对糯玉米自交系种子田间出苗的影响

糯玉米自交系种子播后苗前喷施除草剂20 d，不同自交系对3个单剂型除草剂的敏感性存在较大差异。分析表1正常苗比例及株高等数据可以看出，乙草胺处理后，4个自交系正常苗比例均有明显下降，除N27112外，其他3个自交系均显著低于对照，其中N67111正常苗株高也显著低于对照；与对照相比，莠去津处理后，除N67111正常苗比例有所增加外，其他3个自交系均有下降，但4个自交系的正常苗比例及株高均与对照无显著差异；二甲戊灵处理后，4个自交系正常苗比例同样有明显下降，其中N27112显著低于对照，而4个自交系的株高与对照均无显著差异。

经3种单剂型除草剂处理后，田间小区内均有一定比例的畸形苗发生，其中乙草胺处理的畸形苗比例最高，4个自交系平均达到4.6%，除N329232外，其他3个自交系均显著高于对照；其次为二甲戊灵处理，N27112和N67111小区畸形苗比例显著高于对照，4个自交系平均为3.5%；而莠去津处理后，4个自交系畸形苗比例与对照相比均无显著差异(表1)。

表1 不同除草剂处理对种子田间出苗的影响

此外，从药剂喷施后玉米叶片颜色变化来看，莠去津处理后叶片色泽浓绿，幼苗长势较好；其次为二甲戊灵处理，幼苗长势一般；而乙草胺处理后玉米叶片颜色偏淡，幼苗长势偏弱。综上所述，莠去津处理对糯玉米自交系出苗及幼苗生长的影响相对较小。

2.2 除草剂处理对田间杂草种群密度的影响

试验期间玉米田发现主要杂草类型有12种(表2)，以禾本科杂草和阔叶杂草为主，其中马唐、牛筋草、天蓝苜蓿和空心莲子草等数量较多。

表2 制种田主要杂草种类

从表3可以看出，供试的乙草胺、莠去津和二甲戊灵等3种除草剂对杂草的防除效果明显，均可减少杂草的种类和数量。与对照相比，3种除草剂处理后禾本科杂草数量均显著减少，处理后20 d，禾本科杂草分别减少了61、49和59株·m-2；处理后40 d，禾本科杂草分别减少了152、153和153株·m-2。莠去津和二甲戊灵处理20 d后，阔叶杂草分别比对照减少了29和21株·m-2；40 d，分别减少了25和26 株·m-2，说明莠去津和二甲戊灵对2类杂草具有显著的防除效果。而乙草胺对阔叶杂草的防除效果相对较差，处理后20 d和40 d，小区内阔叶杂草数量与对照相比无显著差异。此外，随着时间的推移，对照小区内禾本科杂草逐渐增加，而阔叶杂草数量不断减少，可见禾本科杂草是本次试验田间的优势杂草种类。

表3 田间不同类型杂草数量

表4统计了处理后田间5种主要杂草。所有处理均有空心莲子草和碎米莎草的发生，说明空心莲子草及碎米莎草对除草剂存在较好的抗性；另外，乙草胺处理的空心莲子草株数显著高于其他2个处理，因此，乙草胺在本次试验中没有防除空心莲子草的效果。田间小区经除草剂处理后，仅存在空心莲子草及碎米莎草，因此，后续只针对这2种杂草进行深入分析，以了解这2种杂草对除草剂的抗性机制。

表4 除草剂处理40 d后田间主要杂草种类及株数

2.3 除草剂处理对空心莲子草和碎米莎草农艺性状的影响

田间小区经莠去津与二甲戊灵处理后，空心莲子草的一次枝梗分枝数、一次枝梗节点数、一次枝梗叶片数、一次枝梗长度均比对照显著减少或缩短，表明这2种除草剂对空心莲子草有较好的防除效果；而乙草胺处理与对照相比均无显著差异，表明了乙草胺处理后对空心莲子草的生长影响较小(表5)。

表5 不同处理小区空心莲子草的生长情况

从表6可知，与对照相比，乙草胺能较好地抑制碎米莎草的叶龄和高度；莠去津能较好地抑制碎米莎草的高度，对碎米莎草的叶龄没有显著影响；二甲戊灵处理后，碎米莎草叶龄较大，但对其高度有显著的抑制作用。

表6 不同处理小区碎米莎草的平均叶龄和高度

2.4 除草剂处理对杂草叶片光合作用及叶绿素含量的影响

2.4.1 除草剂处理对空心莲子草光合作用的影响

与其他处理及对照相比，二甲戊灵处理后空心莲子草净光合速率显著降低，说明二甲戊灵能一定程度上抑制空心莲子草叶片的光合作用，从而影响空心莲子草的生长；而乙草胺和莠去津处理与对照相比，净光合效率没有显著差异(表5)。

2.4.2 除草剂处理对空心莲子草和碎米莎草叶片叶绿素相对含量的影响

从表7可以看出，与其他2种除草剂相比，莠去津处理后空心莲子草的叶绿素相对含量显著降低，仅为20.90，比对照降低了22.40；同样，碎米莎草的叶绿素相对含量也有明显下降。因此，莠去津能抑制这2种杂草叶片叶绿素的合成，田间也可明显地观察到叶片黄化及红化等现象，说明莠去津对空心莲子草显著的防除效果可能与抑制叶片叶绿素合成有关。

表7 除草剂处理后空心莲子草和碎米莎草叶片的叶绿素相对含量

2.5 除草剂处理对空心莲子草和碎米莎草叶片GSH含量及GST活性的影响

从表8可以看出，与对照相比，乙草胺、莠去津和二甲戊灵处理后的空心莲子草和碎米莎草叶片的GSH含量均有明显下降，表明这3种除草剂均能有效地抑制GSH合成；其中莠去津和二甲戊灵处理的空心莲子草和碎米莎草叶片GSH含量均显著下降，抑制GSH合成作用较强；而乙草胺处理的空心莲子草叶片GSH含量与对照相比虽有所下降，但无显著差异。

3种除草剂处理后，空心莲子草的GST活力与对照相比有所上升，但均无显著差异；而3个处理的碎米莎草叶片GST活力显著上升，表明在GST活性方面，碎米莎草对于除草剂的敏感性较强(表8)。

表8 除草剂处理后空心莲子草和碎米莎草叶片GSH含量及GST活性

3 小结与讨论

本研究表明，3个单剂型除草剂均会对糯玉米自交系的出苗和幼苗生长产生不同程度的影响，而不同自交系间的抗性也存在较大差异，因此，在制种和繁种时应在预试验的基础上谨慎选用。其中，莠去津处理对糯玉米自交系出苗及幼苗生长的影响相对较小，正常苗和畸形苗比例、株高等与对照相比均无显著差异，处理后叶片色泽浓绿，幼苗长势较好。

玉米田播后苗前喷施除草剂是一种主动性的保护措施，可以有效地减少苗期杂草危害，降低人工成本。从本次试验结果来看，供试的乙草胺、莠去津和二甲戊灵等3种除草剂对杂草的防除效果显著，均可减少杂草的种类和数量，并能抑制杂草的生长。其中，莠去津和二甲戊灵的防效持久性明显优于乙草胺，特别是乙草胺对空心莲子草的防除效果较差。

为了从单剂型角度进一步了解除草剂对杂草的防除机理及杂草对除草剂的拮抗机制，本试验进一步分析了各处理小区均存活的空心莲子草和碎米莎草等2类杂草的农艺性状及相关生理生化指标。结果表明，莠去津处理后，空心莲子草叶片出现明显的黄化和红化现象，碎米莎草叶片同样黄化明显，特别是空心莲子草叶片叶绿素含量相对显著低于其他2种除草剂处理及对照，其除草机理可能与此有关。与对照相比，二甲戊灵处理能显著降低空心莲子草的光合速率，其除草机制可能与降低了叶片的光合作用有关。由于田间碎米莎草发生少，各处理小区样本量较少，试验结果可能会存在一定的误差。

研究证实，杂草体内除草剂作用位点发生改变、杂草代谢解毒能力增强、杂草的屏蔽作用或与作用位点的隔离作用是杂草对除草剂产生抗性的三大主要机制[13]。本试验分析了2种杂草的GSH含量和GST活性，结果表明，与对照相比，3种除草剂处理后，空心莲子草和碎米莎草叶片中GSH含量下降，GST活性明显上升。推测3种除草剂处理能够引起抗空心莲子草和碎米莎草等杂草GST活性上升，而GST能诱导GSH与除草剂结合，从而完成除草剂在杂草体内的降解代谢，这与前人研究结果一致[14-15]；同时也可能与GST-GSH偶联参与除草剂解毒机制有关[16-18]。具体需要进一步从分子水平探究，以解释和确定其内在的解毒机制。