miR-382-5p在口腔鳞状细胞癌中的表达及其对细胞侵袭迁移的影响和作用机制研究

宋佳凝，冯国维

陕西省西安市儿童医院口腔科，陕西西安 710003

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是口腔癌常见病理分型，起源于口腔黏膜基底细胞层。流行病学调查显示，国内OSCC的发病有年轻化趋势，国内每年约有4.56万OSCC新发病例，5年生存率仅30.0%[1]。既往多关注成人OSCC，而有关OSCC在儿童中的报道较少。肿瘤细胞侵袭迁移是OSCC不良预后的高危因素[2]。既往研究证实，微小RNA(miRNA)作为内源性非编码蛋白质的小分子RNA，参与癌基因的激活或沉默表达，进而调控肿瘤细胞侵袭迁移[3]。报道显示，miR-382-5p在乳腺癌、胃癌等多种恶性肿瘤中异常表达[4-5]，推测miR-382-5p可能参与OSCC肿瘤细胞侵袭。抑癌基因张力蛋白同源基因(PTEN)具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶双重磷酸酶活性，CHEN等[6]提出miR-382-5p与PTEN存在靶向作用关系，推测这可能是miR-382-5p调控OSCC肿瘤细胞侵袭转移的机制之一。为验证上述结果，本研究收集本院12例OSCC患儿临床资料，并开展基础试验研究。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年3月至2021年3月本院收治的12例OSCC患儿作为研究对象，取癌组织和癌旁组织作为检测标本。纳入标准：(1)患儿均经病理活检确诊为OSCC[7]；(2)临床病例资料完整。排除标准：(1)合并有其他恶性肿瘤者；(2)既往接受放化疗或其他抗肿瘤治疗者；(3)合并有严重心肺基础疾病或肝肾功能不全者。12例患儿中男7例，女5例；年龄(9.42±3.36)岁；体质量指数(16.73±2.26)kg/m2；肿瘤部位：舌4例，口底3例，软腭2例，硬腭2例，唇1例；肿瘤分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期3例，Ⅲ期2例；分化程度：低分化6例，中分化5例，高分化1例。

1.2试剂 OSCC细胞CAL-27由中国医学科学院肿瘤研究所提供，DMEM高糖培养基、胎牛血清(FBS)及胰酶-EDTA购自Gibco公司，D-hanks液购自南京森贝伽生物科技有限公司。转染试剂盒购自上海宾智生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1细胞培养和转染 采用含10% FBS的DMEM在37 ℃、5%CO2恒温培养箱中对CAL-27细胞进行培养，取对数生长期细胞，弃培养基后采用D-hanks液洗涤细胞3次，用0.25%胰酶-EDTA消化液消化细胞，在培养皿中进行传代培养。以对数生长期细胞为转染对象，种植于培养板中，培养24 h后，在细胞融合度≥50%时进行转染，以Lipofectamine RNAi Max转染miR-NC和miR-382-5p抑制物至CAL-27细胞，转染方法参照转染试剂盒进行。根据转染内容不同分为si-NC组(以Lipofectamine RNAi Max转染miR-NC)和miR-382-5p抑制物组(以Lipofectamine RNAi Max转染miR-382-5p抑制物)。

1.3.2细胞迁移和侵袭试验 细胞迁移试验：取对数生长期细胞，采用无血清培养基对细胞进行培养，12 h后用胰酶-EDTA消化细胞，制备成106个/毫升浓度的细胞基液；分别在Transwell上室和下室加入100 μL细胞悬液和500 μL含10% FBS的DMEM，在37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养10 h；取出小室，擦净后用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗；采用4%多聚甲醛固定细胞，0.1%结晶紫染色；随机取4～6个视野，计算视野内穿过滤膜细胞数；以平均细胞数为迁移细胞数。细胞侵袭试验：取0.5 g/L Matrigel 人工基质胶20 μL，置于Transwell上室，在37 ℃条件下孵育4.0 h，Matreigel凝固后去残留液体，参照迁移试验方法制备细胞悬液，进行细胞染色，根据干预方法不同将试验细胞分为miR-382-5p抑制物+si-NC组(转染miR-382-5p抑制物阴性序列对照)和miR-382-5p抑制物+si-PTEN组(转染miR-382-5p抑制物+PTEN小干扰RNA)，记录两组细胞侵袭迁移数。

1.3.3qPCR检测 癌组织和癌旁组织解冻后送检，采用Trizol法提取总RNA，以RNA反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，完成后进行qPCR反应，引物设计见表1，反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。以GAPDH为内参，以2-ΔΔCt计算miR-382-5p和PTEN相对表达量。

表1 qPCR引物序列

1.3.4双荧光素酶试验 采用Targetscan(http：//www.targetscan.org)对miR-382-5p进行靶基因预测，PTEN mRNA的野生型3′-UTR和突变型3′-UTR连接psi-CHECK-2载体，分别为PTEN-WT和PTEN-MUT(CAL-27细胞共转染miR-NC或miR-382-5p抑制物200 nmol/L)，根据共转染对象不同分别记为PTEN-WT+miR-NC组、PTEN-WT+miR-382-5p组、PTEN-MUT-miR-NC组及PTEN-MUT-miR-382-5p组。培养48 h后收集细胞裂解，采用Dual-Luciferase®Report Assay System 双荧光报告酶检测系统进行检测。

2 结 果

2.1两组细胞侵袭迁移试验结果 miR-382-5p抑制物组和si-NC组迁移细胞数分别为(178.25±30.29)个和(142.46±26.83)个，两组侵袭细胞数分别为(253.32±62.08)个和(202.41±54.54)个，两组间比较，差异均有统计学意义(t=3.064，2.134；P=0.006，0.044)。

2.2miR-382-5p靶基因 通过软件预测显示，PTEN可能是miR-382-5p潜在靶基因，见图1。miR-382-5p和PTEN在癌组织中的相对表达水平分别为0.87±0.31和0.72±0.26，癌旁组织相对表达水平分别为0.62±0.19和0.51±0.20。癌组织和癌旁组织miR-382-5p和PTEN相对表达水平比较，差异均有统计学意义(t=2.382，2.218；P=0.026，0.037)。双荧光素酶试验检测结果显示，PTEN-WT+miR-NC组和PTEN-WT+miR-382-5p组荧光活性变化倍数分别为0.87±0.12和0.33±0.09，两组间比较，差异有统计学意义(t=12.471，P<0.05)，PTEN-MUT-miR-NC组和PTEN-MUT-miR-382-5p组荧光活性变化倍数分别为0.79±0.22和0.77±0.18，两组间比较，差异无统计学意义(t=0.244，P=0.810)。

注：Targetscan数据库预测显示，PTEN 3′UTR存在miR-382-5p结合位点。图1 Targetscan数据库预测结果

2.3抑制PTEN表达逆转miR-382-5p对CAL-27细胞迁移侵袭的影响 miR-382-5p抑制物+si-NC组和miR-382-5p抑制物+si-PTEN组细胞迁移数分别为(170.45±35.56)个和(274.10±81.36)个,细胞侵袭数分别为(138.96±32.25)个和(180.04±25.63)个，两组间比较，差异均有统计学意义(t=4.044，3.455；P=0.001，0.002)。

3 讨 论

肿瘤细胞侵袭迁移是OSCC生长转移的重要病理基础，而肿瘤细胞与肿瘤局部微环境的相互作用与OSCC发生发展密切相关，二者共同作为靶点[8]，这将是优化OSCC治疗方案的重要方向。肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)是肿瘤微环境主要的间质细胞，来源于骨髓间充质干细胞，基础研究证实CAFs可通过分泌趋化因子、生长因子及细胞外基质，进而加快肿瘤血管内皮细胞增殖，促进肿瘤血管生成[9]。曹娟等[10]还发现CAFs可通过外泌体调控OSCC细胞生物学行为。因而，本研究选取CAF-27作为OSCC细胞进行试验。

miRNA作为非编码单链RNA分子，通过与靶mRNA 3′-UTR区特异性位点结合，降解mRNA，从而调控靶基因，发挥生物学功能，参与肿瘤癌变[11]。miR-382-5p已被证实在多种恶性肿瘤中存在异常表达，赵树鹏等[12]发现miR-382-5p可通过介导PTEN表达，抑制胶质瘤细胞增殖侵袭，而刘冬冬等[13]则发现miR-382-5p可通过抑制PTEN阻断白血病NB4细胞分化。PTEN编码蛋白由N端磷酸酶催化域和C端结构域2个结构域构成，定位于10q23.3染色体，是机体重要抑癌基因，PTEN活性作用可通过磷酸化、泛素化、乙酰化等多种途径参与下游基因的调节，发挥生物学效应[14]。PORS等[15]也认为PTEN可经细胞核参与细胞染色体DNA的修复，并通过PIK/AKT信号通路，调控肿瘤细胞迁移侵袭。另外，PTEN通过小泛素样修饰蛋白分子翻译后途径参与肿瘤生物学行为[16]。但PTEN是否参与CAF-27细胞分裂增殖，临床尚未形成定论。

本研究行细胞侵袭迁移试验，结果显示，miR-382-5p可促进OSCC细胞侵袭，而双荧光素酶试验检测进一步说明PTEN为miR-382-5p的靶基因，提示miR-382-5p可与PTEN的3′-UTR区位点结合，进而调控OSCC生长。另外，本研究行细胞转染和Transwell试验检测，结果显示，miR-382-5p抑制物+si-PTEN组细胞侵袭迁移数显著增加，这提示抑制PTEN表达可逆转miR-382-5p抑制物对CAL-27细胞侵袭迁移的抑制作用。此外，本研究收集OSCC患儿癌组织和癌旁组织，采用qPCR法进一步证实miR-382-5p和PTEN在癌组织和癌旁组织中的相对表达水平不同，结果也说明miR-382-5p可能通过调控PTEN参与OSCC病理进程。

综上所述，miR-382-5p在OSCC患儿中呈高表达，可能通过调控PTEN参与CAL-27细胞的侵袭迁移。