营养物质协同真菌修复石油烃污染土壤

2022-10-09吴燕红龙海波高焕方

化工环保 2022年5期

吴燕红，李聪，龙海波，刘超，石冀，高焕方

（1. 重庆理工大学化学化工学院，重庆 400054；2. 重庆汇亚环保工程有限公司，重庆 400041；3. 泸县应急管理局，四川泸州 646199； 4. 四川实朴检测技术服务有限公司，四川成都 610000）

机油由于运输、使用或储存不当，有时会漫流地面，作为污染物进入环境中［1-2］。机油中含有80%～90%（w）的总石油烃（TPH）［3］，TPH具有致癌、致突变性［4-6］，会破坏生态系统并威胁人类健康［7-8］，且TPH在土壤中具有顽固性和持久性［9-10］，很难将其从环境中去除。目前，我国有大量的石油烃污染土壤未得到合理处置［11］，因此探究一种绿色的有效去除土壤中石油烃的技术尤为必要。

生物修复是指通过酵母菌、真菌、细菌等微生物的作用去除土壤和地下水中的污染物，或使污染物无害化的过程［12］。生物修复技术具有可持续性、环境友好等优点，已成为当前的研究热点［13-17］。生物刺激能促进可降解烃类菌株的生长，生物强化是加入预先驯化的菌株［18］。单独使用生物刺激或生物强化均能提高环境污染物的生物降解率；联合使用时，碳氢化合物的生物降解效果更好、更快［19-20］。从石油污染土壤中分离出的真菌菌株具有一定的降解石油烃的能力［21-23］，但用其修复石油烃污染土壤时，降解率较低［24-25］。WU等［26］分别采用生物强化、生物刺激修复TPH污染土壤，TPH去除率分别为17.5%和30%。而两者协同修复以及可利用营养物质方面的研究报道较少［27］。

本研究将生物刺激与生物强化相结合，探究不同种类营养物质增强真菌杂色曲霉（Aspergillus versicolor）与土著菌株对机油污染土壤中TPH的去除效果，以此筛选最优营养物质，考察生物修复对土壤理化性质、土壤呼吸强度等的影响，以期为TPH污染土壤的生物修复提供参考。

1 实验部分

1.1 土壤试样及菌液

实验所用土壤为某场地洁净土，自然风干一周，研磨，过8目筛，采用40#机油配制成机油含量为7 000 mg/kg的土壤试样，加入一定量的石油醚，搅拌，室外自然风干一个月，放阴凉处老化保存。供试土壤TPH含量5 225 mg/kg，pH 6.52，含水率（w）5.68%，含有机质（w）1.73%。实验所用菌液为真菌Aspergillus versicolor，由重庆某石油烃污染场地土壤中分离，斜面保存。

1.2 材料、试剂及仪器

淀粉、乳糖、牛肉膏、蛋白胨等购自北京奥博星生物技术有限责任公司；蔗糖、草酸、苹果酸、碳酸钠、碳酸钙、磷酸二氢钠、氯化钠、磷酸二氢钙、磷酸二氢铵、硫酸亚铁、尿素、氯化铵、硝酸钠、硝酸钾、无水硫酸钠、酒石酸等均为分析纯。

雷磁PHS-3E型pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；GC-2014型气相色谱仪（岛津公司）； Gemini 300型扫描电子显微镜（德国卡尔-蔡司股份公司）；SEP-100型生化培养箱（上海精其仪器有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 优势营养物质的筛选

在100 g土壤试样中加入20 mL菌液，分别加入质量分数8%的C源（淀粉、乳糖、蔗糖、草酸、苹果酸、酒石酸、碳酸钠或碳酸钙）或质量分数4%的无机盐（磷酸二氢钠、氯化钠、磷酸二氢钙、硫酸亚铁、无水硫酸钠、硫酸铜或磷酸二氢铵）或质量分数4%的N源（氯化铵、硝酸钠、硝酸钾、尿素、牛肉膏或蛋白胨），测定30 d后土壤试样中TPH含量，计算TPH降解率，筛选出可刺激菌株降解作用的优势营养物质。

1.3.2 优势营养物质的降解效果评价

在100 g土壤试样中加入20 mL菌液，加入一定量的优势营养物质，比较修复15 d和30 d后土壤中TPH降解率及土壤pH变化、CO2释放量。

1.4 分析表征

采用电位法测定土壤pH［28］；采用低温外热重铬酸钾氧化-比色法测定土壤有机质质量分数［29］；采用气相色谱法测定土壤试样中TPH的含量［30］。采用SEM观测土壤表面的形貌。

2 结果与讨论

2.1 优势营养物质的确定

不同C源、无机盐及N源作为营养物质刺激菌株修复30 d，土壤中TPH的降解率见图1。综合不同C源、N源、无机盐对土壤菌株的促进作用，以及N源、无机盐过剩会对微生物产生毒害作用抑制其降解的特性，因此选取C源加入质量分数8%，N源、无机盐加入质量分数4%［31］。由图1可见，相比于其他C源、N源或无机盐，加入C源蔗糖和酒石酸时，土壤中TPH降解效果较佳；加入N源TPH降解效果总体比加入无机盐时更差。可以推测，真菌Aspergillus versicolor、污染土壤土著菌直接以石油烃为C源时菌株生长活性低，需要外加C源作为生长媒介。

图1 不同营养物质刺激菌株对土壤中TPH的降解效果

2.2 两种优势C源添加量的优化

蔗糖和酒石酸添加量对土壤试样中TPH降解率的影响见图2。由图2可见：随着蔗糖及酒石酸添加量的增多，TPH降解率均逐渐升高；蔗糖添加量为10%（w，下同）、修复30 d时，TPH降解率达55.63%；酒石酸添加量为7%、修复30 d，TPH降解率为42.9%；继续增加酒石酸添加量，TPH降解率略降低。

图2 蔗糖和酒石酸添加量对土壤试样中TPH降解率的影响

图2表明：添加一定量的蔗糖刺激菌株生长，生物修复土壤中TPH降解效果随时间变化的影响相对较小；而添加酒石酸的30 d修复效果明显优于15 d。因为蔗糖属于双糖，其部分成分能被菌株快速吸收，营养物质消耗快且多，还有部分成分到后期较难被微生物所利用。酒石酸属于可食用有机酸，酸性较强，加入土壤中会明显改变土壤的pH，而支持真菌生长最适pH范围为4.0～6.0，范围之外会影响真菌生长或真菌需要一定的时间去适应土壤环境，故添加酒石酸的TPH降解效果在15 d时远低于添加蔗糖。

2.3 两种优势C源添加对土壤pH的影响

微生物对营养物质的吸收、胞内酶的产生及活性受pH影响较复杂［32］，石油烃污染土壤pH也会随微生物对烃类物质的吸收转化而变化。蔗糖和酒石酸添加对土壤pH的影响见图3。本实验土壤试样的初始pH为6.52，添加蔗糖修复15 d后土壤pH降至4.25～4.65，30 d后土壤pH在4.30～4.34范围内相对稳定，随修复时间增加变化不明显。添加酒石酸修复15 d后土壤pH降至2.14～3.91，波动范围较大；修复30 d后，土壤pH均略有提高，维持在2.35～4.41。可见，添加蔗糖和酒石酸修复后土壤pH均变化较大，总体呈下降趋势，这与VAN BEILEN等［33］的研究结果相符。

图3 蔗糖和酒石酸添加对土壤pH的影响

2.4 两种优势C源修复后土壤的呼吸作用

土壤呼吸作用释放的CO2量主要与微生物、酶活性以及石油烃污染土壤中易受微生物分解转化的碳组分有关［34-35］。土壤试样经菌液及蔗糖、酒石酸生物修复前后的CO2释放量见图4。由图4可知，未加菌液和C源处理的污染土壤在15 d和30 d时，CO2释放量分别为22.28 mL/kg和31.83 mL/kg。

图4 土壤试样经菌液及蔗糖、酒石酸生物修复前后的CO2释放量

添加菌液和蔗糖修复15 d后，CO2释放量为44.57～142.61 mL/kg；修复30 d后CO2释放量均有所增加，但随着蔗糖添加量的增加，CO2释放量逐渐下降。添加菌液和酒石酸修复15 d后，CO2释放量最高仅有26.46 mL/kg；修复30 d后CO2释放量呈倍数增长，最高达69.0 mL/kg。

对比发现，经蔗糖及酒石酸修复处理后土壤的CO2释放量均增大。土壤中TPH降解速率与土壤呼吸作用强度有一定关系，蔗糖修复前期土壤呼吸强度迅速增强，到后期较缓；而酒石酸修复前期土壤呼吸强度几乎没有增强，而在后期迅速增强。

2.5 土壤形貌的SEM表征结果

未受污染土壤、TPH污染土壤以及添加菌液和质量分数10%的蔗糖修复30 d后土壤的SEM照片见图5。由图5可见：TPH污染土壤被原油覆盖［36］，土壤颗粒紧致密实，土壤颗粒之间孔隙被堵塞，会降低土壤渗透性，使得土壤中微生物呼吸作用较弱、活性低，很难进行有效自然降解，土著菌也几乎无法发挥作用；Aspergillus versicolor及蔗糖修复后土壤孔隙结构明显增大，表面粗糙、疏松，呼吸作用增强，能有效去除TPH。