微生物发酵对口含烟烟叶烟碱与特有亚硝胺含量的影响

杨 静， 李书贵， 杨 颜， 潘和平

(1.黔东南州烟草公司， 贵州 凯里 556000； 2.施秉县烟草公司， 贵州 施秉 556200)

0 引言

【研究意义】烟碱(Nicotine)是影响烟叶品质的特征性指标之一[1]，烟碱的含量与烟民的健康密切相关，含量过高可能会对身体健康产生严重危害[2]。近年来，随着国内外控烟形势的日趋严峻，口含烟成为烟草工业企业的重要研究方向之一。口含烟产品质量安全监控的重要指标之一就是烟碱的释放量[3]，同时烟碱对味觉具有很重要的影响，尤其在口含烟中，游离烟碱直接透过口腔黏膜被人体吸收刺激人脑多巴胺的产生从而增加人的满足感[4]。烟叶烟碱含量偏高，导致入口使用时刺激性、辛辣味较重。降低烟碱含量有利于降低烟草原料的辛辣感，从而改善口含烟的刺激感。烟草中特有亚硝胺(Tobacco-specific nitrosamines，简称TSNA)是烟草特有的N-亚硝基类化合物，主要包含N-亚硝基去甲烟碱(NNN)和4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮(NNK)等，是一组主要的致肿瘤物质[5]，是烟叶中重要的有害成分。因此，开展烟叶降害研究对提高烟草原料品质，促进烟草企业健康可持续发展具有重要意义。【前人研究进展】龙章德等[6]从植烟土壤中筛选到一株有效降解烟碱的微生物，并确定其最佳生长条件及其降解烟碱最大的发酵条件，在此条件下其降解率达82%。胡希[7]研究发现，微生物能够降低雪茄烟总植物碱的含量。CHOPYK等[4,8-9]研究发现，微生物发酵对烟叶化学成分和评吸品质有一定的影响，能够很好地降低烟叶烟碱含量，对提高香气量改善香气质有很好的作用。普遍认为烟草中TSNA是由烟草中的生物碱和亚硝盐反应形成，因此亚硝酸盐是生成亚硝胺的前提物之一，所以，降低烟叶中亚硝酸盐含量有助于降低亚硝胺含量，提高口含烟的食用安全性。围绕微生物对烟叶发酵降害作用，国内外学者已经进行了大量有益的探索，并取得了一定进展。有研究发现，微生物的存在对亚硝酸盐含量产生显著影响[10-11]，通过筛选降硝酸盐微生物然后接种到烟叶进行发酵可降低烟叶中亚硝胺含量[12-21]。单宏英等[17]研究发现，醇化烟叶表面的荧光假单胞菌AS97能够显著降低烟草特有亚硝胺(TSNA)的含量。李雪梅等[18]从大量烟草内生细菌中筛选出一株能够显著降低烟草特有亚硝胺含量的菌株——铜绿假单胞菌(PseudomonasaeruginoseKenLXP30)，通过液体发酵制备成烟草降害生物制剂，可显著降低白肋烟烟叶中的TSNA。雷丽萍等[19]筛选出短小芽孢杆菌，其对晾制烟叶发酵处理后TSNAs降低17.3%。赵丽萍等[20]从62个烟叶样品中分离筛选出1株能以烟碱作为碳氮源和能源的11L140巴氏微杆菌，其具有明显的降碱功能。张春花等[21]研究发现，利用微生物发酵能够降低烟叶中农药残留。【研究切入点】从目前的应用情况看，大多数微生物烟叶发酵技术还处于摸索阶段，尚未形成行之有效的适用工业化生产的烟叶发酵技术，且鲜见解淀粉芽孢杆菌(GUHP86)和枯草芽孢杆菌(B01)对烟草不同等级烟叶降害研究的报道。【拟解决的关键问题】采用连续流动分析仪和液相色谱-三重四级杆串联质谱仪(LC-MS-MS)测定解淀粉芽孢杆菌GUHP86和枯草芽孢杆菌B01发酵云烟87不同等级部位烟草原料的烟碱和特有亚硝胺NNN、NNK含量的变化，以期为其在口含烟烟叶提质降害上的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 口含烟原料烟叶 选取贵州省黔东南州烟区生产的云烟87的下橘二(X2F)、中橘三(C3F)和上橘二(B2F)3个部位的烟叶，用清水洗净后分别放入40℃以下烘箱中低温烘干，粉碎密封保存备用。

1.1.2 微生物 解淀粉芽孢杆菌GUHP86和枯草芽孢杆菌B01，由贵州大学酿酒与食品工程学院实验室提供。

1.1.3 发酵培养基 自制。含胰蛋白胨2 g、酵母提取物1 g、NaCl 10 g及葡萄糖1 g，补充蒸馏水至1 000 mL，121℃高压蒸汽灭菌20 min备用。

1.1.4 有糖盐溶液 自制。MgCl20.5 g、KCl 0.5 g、CaCl220.5 g、NaCl 0.5 g、葡萄糖2 g，补充蒸馏水至1 000 mL，溶解灭菌后备用。

1.1.5 仪器与设备 多通道连续流动分析仪、三维随机自动取样器、高精度蠕动、泵双光束比色计，AA3德国SEAL公司；液相色谱-三重四级杆串联质谱仪(LC-MS/MS)，美国Thermofisher公司；Waters Xterra C8s色谱柱50 mm×2.1 mm，粒径3.5 μm，Waters公司；DQ8纯水、超纯水一体系统，法国默克公司。

1.2 方法

1.2.1 制备种子液 准确称取胰蛋白胨1.25 g、酵母提取物0.625 g、NaCl 6.25 g、葡萄糖0.625 g加入1 000 mL容量瓶定容至刻度，121℃高压蒸汽灭菌20 min，待冷却后接入菌种，180 r/min、37℃培养18 h。解淀粉芽孢杆菌GUHP86种子液活菌浓度为9.58 CFU/mL、枯草芽孢杆菌B01种子液活菌浓度为9.56 CFU/mL。在无菌操作台中将培养好的菌株分别放入均等的大离心管中，于1 350 r/min离心10 min。离心以后，倒出上清液，保留菌体，然后加入20 mL灭菌生理盐水，摇匀备用。

1.2.2 烟草原料发酵 试验设3个处理：T1，烟叶分别加入20% GUHP86+20%有糖盐溶液，37℃发酵20 d；T2，加入30% B01+25%有糖盐溶液，37℃发酵20 d；空白对照(CK)，不添加微生物进行发酵。分别称取3个部位(X2F、C3F和B2F)的烟叶粉末各20 g分别装入14 cm×10 cm的无菌密封袋，灭菌。按试验设计吸取适量离心管内菌液于烟粉塑封袋内，适量加入盐溶液，充分混匀，贴上标签放入恒温培养箱内进行发酵，每天需进行换气，分别取0 d、5 d、10 d、15 d和20 d的发酵烟草原料，将烟粉在115℃下灭菌20 min后[22-23]，测定烟碱及特有亚硝酸盐含量。

1.2.3 样品检测 烟碱参照《烟草及烟草制品总植物碱的测定 连续流动法》(YC/T 468—2013)[23]进行测定。特有亚硝胺参照文献[24-26]的方法采用液相色谱-三重四级杆串联质谱仪定量分析检测。

2 结果与分析

2.1 不同微生物发酵各部位烟叶的烟碱含量

从图1看出，3个部位烟叶的烟碱含量随各微生物发酵时间延长均呈慢快慢下降趋势。

2.1.1 X2F 发酵0～10 d时各处理烟叶的烟碱含量均缓慢下降，T1下降最多，降解率为5.95%；T2其次，降解率为5.00%；CK最少，降解率为2.73%。发酵10～15 d时T1和T2的烟碱含量急剧下降，CK仍下降缓慢，至15 d时T1和T2较0 d时分别下降17.30%和11.11%，均较CK(6.01%)降解快。发酵15～20 d时，烟碱含量又恢复缓慢下降趋势，至20 d时，T1、T2和CK较0 d时分别下降19.46%、15.00%和7.65%，T1下降最多，T2次之。

2.1.2 C3F 发酵0～10 d时各处理烟叶的烟碱含量均缓慢下降，T2下降最多，降解率为9.25%；T1其次，降解率为5.50%；CK最少，降解率为3.05%。发酵10～15 d时T1和T2的烟碱含量急剧下降，CK仍下降缓慢，至15 d时T1和T2较0 d时分别下降38.14%和33.81%，T1的降速大于T2，二者均较CK(5.61%)降解快。发酵15～20 d时，烟碱含量又恢复缓慢下降趋势，至20 d时，T1、T2和CK较0 d时分别下降40.89%、38.43%和8.77%，T1下降最多，T2次之。

2.1.3 B2F 发酵0～10 d时各处理烟叶的烟碱含量均缓慢下降，T1下降最多，降解率为9.33%；T2其次，降解率为6.92%；CK最少，降解率为5.09%。发酵10～15 d时T1和T2的烟碱含量急剧下降，CK仍下降缓慢，至15 d时T1和T2较0 d时分别下降44.04%和40.00%，均较CK(6.97%)降解快。发酵15～20 d时，烟碱含量又恢复缓慢下降趋势，至20 d时，T1、T2和CK较0 d时分别下降50.78%、44.36%和8.58%，T1下降最多，T2次之。

总体看，T1对烟碱的降解效果最好，T2次之，2种微生物的降解效果集中在发酵后10～15 d，最佳发酵时间为15 d。

2.2 不同微生物发酵各部位烟叶的特有亚硝酸盐含量

2.2.1 N-亚硝基去甲烟碱(NNN) 从图2看出，3个部位烟叶的NNN含量随不同微生物发酵时间延长均呈慢快慢降低趋势。

1) B2F。发酵0～10 d时各处理烟叶的NNN含量均缓慢下降，T2下降最多，降解率为19.96%；T1其次，降解率为17.42%；CK最少，降解率为5.27%。发酵10～15 d时T1和T2的NNN含量急剧下降，CK仍下降缓慢，至15 d时T1和T2较0 d时分别下降51.49%和42.98%，T1的降速超过T2，二者均均较CK(5.82%)降解快。发酵15～20 d时，NNN含量又恢复缓慢下降趋势，至20 d时，T1、T2和CK较0 d时分别下降64.39%、55.59%和7.58%，T1下降最多，T2次之。

2) C3F。发酵0～10 d时各处理烟叶的NNN含量均缓慢下降，T2下降最多，降解率为19.44%；T1其次，降解率为14.33%；CK最少，降解率为3.94%。发酵10～15 d时T1和T2的NNN含量急剧下降，CK仍下降缓慢，至15 d时T1和T2较0 d时分别下降54.27%和44.31%，T1的降速超过T2，二者的降速均超过CK(6.19%)。发酵15～20 d时，NNN含量又恢复缓慢下降趋势，至20 d时，T1、T2和CK较0 d时分别下降59.62%、54.86%和7.45%，T1下降最多，T2次之。

3) X2F。发酵0～10 d时各处理烟叶的NNN含量均缓慢下降，T2下降最多，降解率为8.54%；T1其次，降解率为7.78%；CK最少，降解率为4.21%。发酵10～15 d时T1和T2的NNN含量急剧下降，CK仍下降缓慢，至15 d时T1和T2较0 d时分别下降19.26%和25.27%，均较CK(5.61%)降解快。发酵15～20 d时，NNN含量又恢复缓慢下降趋势，至20 d时，T1、T2和CK较0 d时分别下降28.15%、35.23%和7.02%，T2下降最多，T1次之。

总体看，T1对B2F和C3F烟叶NNN的降解效果最好，对X2F的降解效果次于T2；2种微生物的降解效果集中在发酵后10～15 d，最佳发酵时间为15 d。

2.2.2 4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮(NNK) 从图3看出，3个部位烟叶的NNK含量随不同微生物发酵时间延长均呈慢快慢下降趋势。

1) B2F。发酵10 d时各处理烟叶的NNK含量下降4.29%～29.41%，T1下降最多，T2其次，降解率为26.23%，CK最少。发酵10～15 d时T1和T2的NNK含量急剧下降，CK仍下降缓慢，至15 d时T1和T2较0 d时分别下降60.78%和59.57%，均较CK(5.26%)降解快。发酵15～20 d时，NNK含量又恢复缓慢下降趋势，至20 d时，T1、T2和CK较0 d时分别下降63.73%、65.68%和8.38%，T2下降最多，T1次之。

2) C3F。发酵10 d时各处理烟叶的NNK含量下降3.59%～11.86%，T1下降最多，T2其次，降解率为11.61%，CK最少。发酵10～15 d时T1和T2的NNK含量急剧下降，CK仍下降缓慢，至15 d时T1和T2较0 d时分别下降54.55%和32.21%，均较CK(5.98%)降解快。发酵15～20 d时，T1的NNK含量呈缓慢下降趋势，而T2的NNK含量仍呈快速下降趋势；至20 d时，T1、T2和CK较0 d时分别下降58.50%、55.43%和7.97%，T1下降最多，T2次之。

3)X2F。发酵10 d时各处理烟叶的NNK含量下降2.16%～9.04%，T1下降最多，T2其次，降解率为4.44%，CK最少。发酵10～15 d时T1和T2的NNK含量急剧下降，CK仍下降缓慢，至15 d时T1和T2较0 d时分别下降27.68%和32.22%，T2的降速超过T1，均较CK(5.94%)降解快。发酵15～20 d时，NNK含量又恢复缓慢下降趋势，至20 d时，T1、T2和CK较0 d时分别下降33.33%、41.67%和7.57%，T2下降最多，T1次之。

总体看，T2对B2F和X2F烟叶NNK的降解效果最好，对C3F的降解效果次于T1；2种微生物的降解效果集中在发酵后10～15 d，最佳发酵时间为15 d。

3 讨论

口含烟是烟草以粉末形式在口腔中使用，烟草的烟碱等成分溶出后通过口腔黏膜吸收。因直接入口腔，口含烟对烟草原料品质安全要求苛刻，其品质直接决定口含烟产品的风味特色和使用安全性。而一般新烤的烟叶具有很重的青杂气，烟碱含量大、刺激性高，且含有对人体健康造成不良影响的烟草特有亚硝胺。目前已可以使用发酵醇化技术改进上述缺陷。单宏英等[17-19]分别证明荧光假单胞菌AS97、铜绿假单胞菌和短小芽孢杆菌均可显著降低烟草的TSNA含量。赵丽萍等[20]从62个烟叶样品中分离筛选出1株能以烟碱作为碳氮源和能源的11L140巴氏微杆菌，其具有明显的降碱功能。该研究结果表明，解淀粉芽孢杆菌GUHP86和枯草芽孢杆菌B01均具有降烟碱和特有亚硝胺的作用，与前人的研究结果类似。解淀粉芽孢杆菌GUHP86的降解效果较枯草芽孢杆菌B01好，可能是GUHP-86发酵烟叶时生成了具纳豆激酶活力和蛋白酶活力等对人体有益的酶[27]，起到促进烟碱降解的作用。不同部位降解率不一样，可能是因为其内涵物质及含量不同，也可能是因为烟草中特有亚硝胺与烟碱含量呈极显著正相关[28-29]，具体还有待进一步探索。

4 结论

解淀粉芽孢杆菌GUHP86和枯草芽孢杆菌B01均具有一定的降烟碱作用，发酵20 d时，解淀粉芽孢杆菌GUHP86对不同部位烟叶烟碱的降解率存在差异，表现为B2F(50.78%)>C3F(40.89%)>X2F(19.46%)，枯草芽孢杆菌B01降解效果次于GUHP86，其对不同部位烟叶的降解率也不同，表现为B2F(44.36%)>C3F(38.43%)>X2F(15.00%)。解淀粉芽孢杆菌GUHP86降烟碱的效果较枯草芽孢杆菌B01好，2种微生物最佳发酵时间为10～15 d；发酵15 d时，2种微生物对不同部位烟叶烟碱的降解率分别为X2F 17.30%和11.11%，C3F 38.14%和33.81%，B2F 44.04%和40.00%。

解淀粉芽孢杆菌GUHP86和枯草芽孢杆菌B01均能降低烟草原料的特有亚硝胺NNN和NNK含量，GUHP86对NNN的降解率表现为B2F(64.39%)>C3F(56.73%)>X2F(28.15%)，B01对NNN的降解率表现为B2F(55.60%)>C3F(54.86%)>X2F(53.23%)；GUHP86对NNK的降解率表现为B2F(63.73%)>C3F(59.28%)>X2F(33.33%)，B01对NNK的降解率表现为B2F(65.68%)>C3F(55.43%)>X2F(41.67%)，表明，GUHP86和B01对B2F特有亚硝胺NNN和NNK的降解率最高，C3F次之，X2F最低，降解效果最好的时间段为发酵后10～15 d，发酵15 d时，2种微生物对不同部位烟叶NNN的降解率分别为B2F 51.49%和42.98%，C3F 54.27%和44.31%，X2F 19.26%和25.27%，GUHP86对B2F和C3F烟叶NNN的降解效果较B01好，对X2F的降解效果次于B01；NNK降解率分别为B2F 60.78%和59.57%，C3F 54.55%和32.21%，X2F 27.68%和32.22%，B01对B2F和X2F烟叶NNK的降解效果较GUHP86好，对C3F的降解效果次于GUHP86。