脱铬皮屑发酵液作为有机肥料的功效研究

卢欣雨，张晓伟，张佳兴，赵胜宗，刘彦＊

（1.四川大学生物质与皮革工程系，四川 成都 610065；2.四川大学制革清洁技术国家工程实验室，四川 成都 610065）

引言

目前，我国的化肥产量和使用量常年位居世界第一，这与我国人口基数大、耕地面积少的国情有着密切的关系。另外，农民重化肥而轻有机肥和过于追求高产的观念导致我国普遍存在化肥施用过量的情况[1-2]。化肥的过度施用会导致土壤酸化板结、盐渍化加重、有机质含量降低、肥力下降、病虫害发病率增高以及影响土壤微生物稳定性等[3]。与化肥相比，有机肥料不仅包含植物所需的氮、磷、钾等无机元素，而且含有有机酸、肽类等有机物质，其营养更全面，肥效更长，而且可以改善土壤环境。早在2015年，农业部就开展了到2020年化肥农药使用量零增长行动，旨在减少不合理的化肥投入，推进有机肥的资源化利用[4]。合理利用蛋白类有机肥则可减少不合理的化肥投入，为实现高产无公害蔬菜果品生产的水肥一体化种植方式，提供重要的农作物生长所必需的持续性营养来源。

在农业中，用氨基酸作为蛋白类有机肥料的应用较多。氨基酸肥能够为植物提供各种氨基酸类营养物质，具有增产、改善果实品质、抗逆、改良土壤、提高药物利用率等特点[5]。氨基酸是蛋白质的最终水解产物，分子量小，可被植物快速直接吸收利用，能够及时地为植物提供营养，但基本不具有持续性肥效。与氨基酸肥料相比，多肽类物质在农业中的应用尚不多见。肽是蛋白质不完全水解的产物，包括小分子肽和多肽两大类，我们通常将由11～50个氨基酸组成的化合物称为多肽，将由2～10个氨基酸构成的化合物称为小分子肽或者寡肽[6]。小分子肽同氨基酸一样，可以被植物直接吸收利用，而多肽由于分子量较大，只有被土壤中的微生物缓慢降解后，才能为植物所利用，因此其具有持续肥效。有研究表明，多肽类肥料不仅可以为作物提供有机态营养成分，而且对作物的生理功能调节、细胞组织活化、促进生长、提高作物抗逆性、增强作物抗病性、增产增收、改善果实品质具有明显的效果[7]。可见，氨基酸和多肽类有机肥在农业生产中都具有较高的应用价值。

随着我国耕地面积不断地减少，无土栽培技术越来越受到青睐。无土栽培是以营养液等人工制造的根系生长环境代替天然土壤环境，让作物的根系始终处于适宜的生长环境条件中，从而使作物发挥最大增产潜力[8]。与土壤栽培相比，采用无土栽培可减少农药的使用量，克服土传病害和连作障碍，实现高产以及生产无公害的蔬菜和果品[9]。此外，无土栽培可实现高度自动化，从而节省人力物力，也是实现水肥一体化的重要种植方式之一。

前期研究表明，作为制革含铬固体废弃物资源化利用的产物，脱铬皮屑发酵液中富含游离氨基酸和多肽类物质等营养元素，水溶性好，具备作为生物有机缓释肥的潜能，将其应用于植物种植可能会比单一肥料产生更好的效果，且可能在无土栽培技术中具有较好的应用前景。本文拟采用无土栽培的方式，将脱铬皮屑发酵液应用于种子萌发和植物栽培，对脱铬皮屑发酵液作为植物生长有机缓释肥的肥效进行研究，评估其在植物栽培方面的应用前景。

1 实验部分

1.1 主要材料与仪器

脱铬皮屑发酵液：本实验室自制。由自然降解的废皮液中筛选得到的地衣芽孢杆菌对脱铬皮屑[10]进行发酵得到，主要成分为易于植物吸收（分子量≤14.4 kDa）的游离氨基酸（脯氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和组氨酸）和小分子肽类物质，总游离氨基酸质量浓度为1 g/L，总肽质量浓度为13.21 g/L，铬质量分数为2.91 mg/kg。

市售含氨基酸水溶肥（推荐使用质量浓度为100 mg/L）：永济市禾丰源肥业有限公司。含有钙、镁、硫、硼、钾、氨基酸、蛋白酶、植物生长促进剂等物质。

材料：试剂均为国产分析纯；苜蓿种子，沭阳县楚汉园林绿化工程有限公司；小麦种子，仲衍种业股份有限公司；

仪器：HSP-80B恒温恒湿培养箱，上海坤天实验仪器有限公司；SQP电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；UV-1100型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；LG10-2.4A高速离心机，北京医用离心机厂。

1.2 实验内容与方法

1.2.1 作为浸种剂

选取不同营养存储的苜蓿种子和小麦种子作为发芽实验材料，用不同稀释质量浓度的脱铬皮屑发酵液对其进行浸种处理，以期获得促进种子高效萌发的最适发酵液质量浓度和最佳发芽效果，以及考察脱铬皮屑发酵液对不同营养存储种子发芽的影响[11-14]。

1.2.1.1 作为苜蓿种子浸种剂

将脱铬皮屑发酵液离心除菌后进行稀释，使稀释后发酵液的游离氨基酸质量浓度分别为20、40、60、80、100、120 mg/L。挑选大小均匀的苜蓿种子100颗，分别用不同氨基酸含量的发酵液（用量为种子质量的5倍）于25℃下浸泡12 h。将浸泡好的种子整齐地摆放在垫有滤纸的表面皿中（滤纸用相应氨基酸含量的发酵液润湿），然后将表面皿置于温度为25℃，湿度为60%的恒温恒湿培养箱中进行培养，观察并记录种子发芽情况。空白对照为用水代替脱铬皮屑发酵液作为浸种剂，其它操作相同。

发芽率=（发芽个数/100）×100%

1.2.1.2 作为小麦种子浸种剂

种子换为小麦种子，其余步骤同1.2.1.1。

1.2.2 作为小麦苗水培营养液

将脱铬皮屑发酵液离心除菌后进行稀释备用，使稀释后发酵液的游离氨基酸质量浓度分别为20、40、60、80、100 mg/L。称取大小均匀的小麦种子4 g，加入5倍种子质量的自来水于25℃下浸泡12 h。将浸泡好的种子整齐地摆放在垫有滤纸的表面皿中，然后将其置于温度为25℃，湿度为60%的恒温恒湿培养箱中，用自来水培养。待小麦种子营养消耗殆尽时，倒掉表面皿中残留的水，加入一定量上述稀释的发酵液，使得发酵液刚好淹没麦苗根部，然后放入恒温恒湿培养箱中继续培养（培养过程中补加适量自来水，使得麦苗根部刚好被淹没）。每7天观察记录一次小麦的植株高度，并拍照记录小麦的生长状况。空白对照组和阳性对照组分别用自来水和市售含氨基酸（质量浓度100 mg/L）水溶肥来代替脱铬皮屑发酵液，其它操作相同。

小麦种子经过一周常规育苗培养，两周施肥培养后收苗，对麦苗植株的高度和干湿重及水分含量、叶片的叶绿素和蛋白质含量等品质参数进行测定。

1.2.2.1 麦苗株高

用直尺测定麦苗茎基部到最高叶片的距离。

1.2.2.2 麦苗植株的干湿重及水分含量

将麦苗连根拔起，去根部，称量，计为湿质量。将称量部分置于恒温干燥箱中在100℃下杀菌0.5 h，然后在80℃下烘干至恒量，恒量结果计为干质量。

麦苗植株的含水量=（麦苗植株湿质量-麦苗植株干质量）/麦苗植株湿质量×100%

1.2.2.3 小麦叶片的叶绿素含量[15]

准确称取0.5 g新鲜小麦叶片，捣碎匀浆，加入100 mL体积比为1∶1的乙醇、丙酮混合提取液后，放置室温下避光处静置提取5 h，过滤，滤液待测。以提取剂为空白溶液，分别在波长为645 nm和663 nm处测定滤液的吸光度值。

叶绿素a=(12.72×A663-2.59×A645)×V/(1000×m)

叶绿素b=(22.88×A645-4.67×A663)×V/(1000×m)

总叶绿素=(8.05×A663+20.29×A645)×V/(1000×m)

式中：叶绿素a、b、总叶绿素，mg/g；V为提取液的总体积，mL；m为样品的鲜重，g。

1.2.2.4 小麦叶片的蛋白质含量[16]

准确称取0.2～2.0 g烘干的小麦叶片，放入100 mL定氮瓶中，加入0.4 g硫酸铜、6 g硫酸钾及20 mL硫酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗。将定氮瓶置于电炉上加热碳化，直至液体颜色呈蓝绿色并澄清透明后，继续加热0.5 h。关闭电源，取下定氮瓶，加入20 mL水，冷却后定容到100 mL容量瓶中。空白实验为不加小麦叶片，其它操作相同。采用凯氏定氮法对处理好的样品进行蛋白质含量的测定，按照式（1）进行计算。

式中：X为样品中蛋白质的质量分数，%；V1为样液消耗硫酸标准液体积(mL)；V2为空白试剂消耗硫酸标准液的体积(mL)；V3为吸取消化液的体积(mL)；C为硫酸标准溶液的浓度(mol/L)；0.0140为与1 mL硫酸[c(1/2 H2SO4)=1.000 mol/L]标准溶液相当的氮质量(g)；6.25为氮换算为蛋白质的系数。

2 结果与讨论

2.1 作为种子浸种剂

观察发芽前的苜蓿种子和小麦种子可知，两类种子的个体差别很大，单个小麦种子比单个苜蓿种子重大约20倍，因而小麦种子的营养储存较苜蓿种子丰富。

2.1.1 苜蓿种子发芽情况

由图1可以看出，苜蓿种子的发芽率随着时间的延长而增加。培养24 h，种子基本上还处于未发芽阶段；48 h后，已有近一半的种子开始发芽；72 h后，所有组的种子发芽数量均已过半。相比于水培苜蓿种子，实验组的发芽率均更高，且不同质量浓度脱铬皮屑发酵液浸种处理的苜蓿种子的发芽率随着发酵液质量浓度的升高先增加后减少，质量浓度为80 mg/L时发芽率最高，这说明适宜质量浓度的发酵液浸种处理苜蓿种子可以起到催芽作用，且最佳催芽质量浓度为80 mg/L。经过72 h培养，还有约1/3的种子没有发芽，可以考虑通过适当延长时间来提高发芽率。

图1 苜蓿种子发芽情况Fig.1 Germination rates of alfalfa seeds

2.1.2小麦种子发芽情况

图2显示，不同浸种处理的小麦种子在24 h时大部分都已发芽，48 h后的发芽率几乎没有明显的变化，说明小麦种子的发芽此时已基本结束。24 h、48 h和72 h三个阶段的小麦种子发芽率都随着浸种质量浓度的升高反而逐渐降低，说明较高质量浓度发酵液的浸种处理对小麦种子的发芽有一定的抑制作用，且发酵液质量浓度越高抑制作用越强。这可能与小麦种子自身的结构有关，小麦种子大、子叶肥厚，具有足够的营养用于发芽，额外施加高营养的蛋白发酵液会使种子发芽时营养过剩，造成种子生长活力下降，从而抑制发芽。因此，在实验所用的质量浓度范围内，发酵液对小麦种子没有催芽作用。

图2 小麦种子发芽情况Fig.2 Germination rates of wheat seeds

2.2 作为小麦苗水培营养液

2.2.1 麦苗株高

由图3可以看出，施肥麦苗的平均高度均比水培的高，这说明有机蛋白类肥料可以促进麦苗植株的生长。而施肥组中，对比于市售肥料，质量浓度在40～100mg/L的实验组麦苗株高均有明显增加，这可能是因为质量浓度较高的发酵液中尚存在较多的小分子肽和多肽等，它们被微生物分解后能够给植物生长提供源源不断的营养成分供给。其中，质量浓度同为100 mg/L的实验组植株高度比市售肥料的高，说明脱铬皮屑发酵液比一般市售的氨基酸肥营养成分更丰富。因此，脱铬皮屑发酵液作为一种植物生长生物有机缓释肥，具有较好的应用前景。

图3 麦苗株高Fig.3 Plant height of wheat

2.2.2 麦苗植株的干湿重及水分含量

由图4可以看出，与水培麦苗相比，施肥处理的麦苗鲜重、干重和水分含量均有所增加，且实验组的麦苗鲜重、干重和水分含量随着施肥质量浓度的升高呈现上升趋势，而市售肥料组麦苗的鲜重、干重和水分含量远不如质量浓度同为100 mg/L的实验组。干重可以反映小麦苗对有机物质的合成和积累，麦苗的鲜重、干重和水分含量皆在发酵液质量浓度为100 mg/L时达到最高值。因此，脱铬皮屑发酵液对麦苗鲜重、干重和水分含量的增加都有明显的促进作用。

图4 麦苗植株的质量及水分含量Fig.4 Plant weight and moisture content of wheat seedling

2.2.3 小麦叶片的叶绿素含量

由图5可以看出，与水培小麦相比，经过施肥处理的小麦叶片叶绿素含量均明显增加，这主要是因为脱铬皮屑发酵液和市售肥料都属于高氮肥料，而氮元素又是组成叶绿素的重要元素，所以施加一定量的肥料可以促进植物叶绿素的合成。不同质量浓度发酵液施肥处理的小麦之间的叶绿素含量变化极小，且随着质量浓度的升高反而有所降低。这可能是由于施肥质量浓度高时，新生叶片多且生长快，但是叶绿素的合成和积累要相对迟缓一些，所以造成叶绿素含量随着质量浓度的升高不升反降。经过发酵液施肥处理的小麦叶片叶绿素含量均低于市售肥料组，造成这一差异的原因可能是市售肥料含有使叶片变绿的成分（非蛋白氨基酸—5-氨基乙酰丙酸），该物质是促进叶绿素合成的前体物质，能够直接促进叶绿素合成，防止叶片枯黄。综上所述，施用不同质量浓度的脱铬皮屑发酵液能明显增加小麦叶片的叶绿素含量，在施肥质量浓度为20 mg/L时其叶绿素含量最高。

图5 小麦叶片的叶绿素含量Fig.5 Chlorophyll contents of wheat leaves

2.2.4 小麦叶片的蛋白质含量

由图6可知，施加肥料的小麦叶片蛋白质含量均比水培的高，说明施加蛋白类肥料可以促进小麦叶片蛋白质的合成。实验组的小麦叶片蛋白质含量随脱铬皮屑发酵液质量浓度的增加呈明显上升的趋势，并在100 mg/L时达到最高值，并显著高于质量浓度相同的市售肥料培养的小麦叶片蛋白质质量分数。由此看来，脱铬皮屑发酵液营养丰富，可以显著提高小麦叶片的蛋白质质量分数。

图6 小麦叶片的蛋白质质量分数Fig.6 Protein contents of wheat leaves

3 结论

（1）浸种实验结果表明，脱铬皮屑发酵液质量浓度越高，苜蓿种子发芽率就越高，且最佳催芽质量浓度为80 mg/L，反之，小麦种子发芽率就越低。脱铬皮屑发酵液的浸种处理效果与种子的起始营养状态密切相关，适宜质量浓度的脱铬皮屑发酵液可明显促进颗粒较小的苜蓿种子发芽，而对于小麦这种自身营养比较丰富的大种子，催芽效果并不明显。

（2）小麦苗水培实验结果表明，施加适量质量浓度的脱铬皮屑发酵液对小麦苗的生长具有明显的促进效果，可显著增加麦苗植株的高度和干湿重及水分含量、叶片的叶绿素和蛋白质含量，且最佳施肥质量浓度为100 mg/L。