灵芝孢子油番茄红素复合物的抗肿瘤作用

2022-10-09井子良吴纯宇张慧敏孙建博

现代食品科技 2022年9期

井子良，吴纯宇，张慧敏，孙建博*

（1.中国药科大学中药学院，江苏南京 210009）（2.江苏盛世康禾生物技术有限公司，江苏常州 213032）

在肿瘤治疗过程中，中草药以及天然植物毒副作用少、临床应用广、提高免疫能力明显，是辅助肿瘤治疗的最佳药物。灵芝是一味历史悠久的中药，最早记载于《神农本草经》，被列为上品药材，是最受推崇的中药之一。灵芝孢子油是从破壁的灵芝孢子粉中提取得到的油状脂质物，含有三萜及甾醇类、核苷类、脂肪酸、维生素等多种成分[1]。现代药理和临床研究表明灵芝具有调节血脂、提高免疫力、改善心脑血管和呼吸功能等功效[1]。此外，灵芝及其提取物不仅可通过提高免疫力抑制肿瘤，还具有直接抗肿瘤作用，且其抑瘤作用呈浓度依赖性[1]。番茄红素结构中存在的大量不饱和双键，能够有效地吸收长波和淬灭单线态氧，是自然界中抗氧化能力极强的疏水性无环类胡萝卜素，抗氧化能力是维生素E的100倍[2]。番茄红素具有防治糖尿病血管并发症、增强免疫力、预防前列腺癌和心血管疾病等功能[3,4]。已有研究证实，番茄红素还能在一定程度上抑制胃癌、卵巢癌等癌症的进展[3,4]。

灵芝孢子油番茄红素复合物（LZFQ）是将灵芝孢子油作为主要成分，加入适量番茄红素作为辅料复合配比组成，复方中总三萜含量占比22.22%，番茄红素含量占比16.67%。该复合物有望通过灵芝孢子油和番茄红素的协同作用发挥有效的抗肿瘤活性。本实验研究了LZFQ对人非小细胞肺癌细胞（A549）、人胃癌细胞（BGC823）、人乳腺癌细胞（MCF-7）和人结肠癌细胞（HCT116）的生长活性影响，通过裸鼠移植瘤模型研究LZFQ在体内对肿瘤的抑制作用，并对LZFQ的抗肿瘤活性机制进行初步探讨，旨在证实灵芝孢子油和番茄红素复合物具有开发为优良抗肿瘤活性制剂的潜力，以期为灵芝孢子油和番茄红素药学研究和临床应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂

灵芝孢子油番茄红素复合物（批号：20210326），购自康道生物（南通）有限公司；RPMI-1640不完全培养基（货号：KGM31800-500）、DMEM不完全培养基（货号：KGM12800NH-500）、胰蛋白酶（货号：KGY0012）、PBS（货号：KGB5001）、Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒（货号：KGA108），江苏凯基生物技术股份有限公司；胎牛血清（货号：04-001-1ACS），Biological Industries；四甲基噻唑蓝（ST316），碧云天；DMSO，国药试剂公司；环磷酰胺（批号：SLBC0666V），杭州吉诺医药生物科技有限公司。

1.2 细胞株

人非小细胞肺癌细胞（A549）、人胃癌细胞（BGC823）、人乳腺癌细胞（MCF-7）和人结肠癌细胞（HCT116）来源于凯基生物技术股份有限公司。

1.3 仪器与设备

60L/TOMSX-700高压蒸汽灭菌锅，Tomy Digital Biology；ESCO ISOtherm烘箱，新加坡艺思高科技有限公司；MSC-Advantage生物安全柜，Thermo；HERAcell 150i CO2培养箱，Thermo；TDZ4A-WS台式低速离心机，湘仪；Ts100倒置显微镜，Nikon；MX-F漩涡混匀仪，赛洛捷克；POLARstar多功能酶标仪，Omega；Ts2R倒置荧光显微镜，Nikon；Accuri C6小型流式细胞仪，BD Biosciences；FV3000激光共聚焦显微镜，Olympus。

1.4 MTT实验

细胞培养在含10%体积分数的胎牛血清（FBS）的DMEM培养液中，并孵育在含体积分数5% CO2的恒温（37 ℃）孵箱内。细胞培养一段时间后，首先用显微镜观察，判断细胞状态是否良好和数量是否达到80%以上，若符合以上条件，即可进行传代，首先将旧培养基除去，PBS清洗；其次加入1 mL胰酶（含EDTA）消化，均匀摇晃培养盘，保证胰酶能与培养盘表面充分接触，根据细胞种类的不同，在培养箱中消化不同时间（本实验所用细胞消化时间为1～3 min），消化结束后可进行镜检；加入完全培养基终止消化，通过吹打可见细胞成流沙状掉落，收集细胞，1 000 r/min，离心5 min，除上清；最后使用培养基重悬细胞，将适量悬液打入培养盘中，放置在37 ℃培养箱中。当细胞状态处于指数生长期时准备接种，先倾倒培养液，PBS洗涤1次，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化液消化约2 min，加入1 mL含10%胎牛血清的完全培养基，1 000 r/min离心5 min，倾倒上清液，细胞计数并稀释至每毫升5×103个，并将细胞悬液以每孔200 μL接种于96孔板上，置恒温CO2培养箱中培养24 h。加入不同浓度（0.125、0.25、0.50 mg/mL）的LZFQ和对照药物灵芝孢子油（LZBZ），每组设3个复孔，培养24 h。将MTT试剂加入96孔板中（每孔20 μL），培养箱孵育4 h。用酶标仪在570 nm波长处测吸光值（OD值），并计算细胞抑制率和受试化合物的IC50值。

1.5 细胞凋亡实验

将处于对数生长期的A549细胞消化下来，接种于6孔板中（每孔4×105个细胞），置于恒温CO2培养箱中培养24 h，然后吸去旧的培养基，根据组别设置加入不同浓度（0.125、0.25、0.50 mg/mL）的LZFQ含药培养基，同时设立阴性对照组（DMSO）。在药物作用48 h后，用不含EDTA的胰酶消化液消化细胞，加入1 mL的完全培养基终止消化，根据组别设置，转移至相应的5 mL离心管中，2 000 r/min离心5 min。吸去上清液，加入1 mL的PBS，将细胞团块吹打均匀后转移至1.5 mL的离心管中，2 000 r/min离心5 min，吸去上清液，加入1 mL的PBS，再次离心沉淀细胞。吸去上清液，然后将细胞重悬于500 μL缓冲液中，依次加入Annexin V-FITC（5 μL）和碘化丙啶PI（5 μL），室温避光条件下孵育15 min后用流式细胞仪在488 nm处检测细胞凋亡情况。

1.6 Western blot实验

将处于对数生长期的A549细胞消化下来，接种于6孔板中（每孔4×105个细胞），置恒温CO2培养箱中培养24 h，然后吸去旧的培养基，根据组别设置加入不同浓度（0.125、0.25、0.50 mg/mL）的LZFQ含药培养基，同时设立阴性对照组（DMSO）。在药物作用24 h后，收集并用细胞裂解液（RAPI）裂解细胞，提取蛋白，将蛋白浓度稀释至3 mg/mL（BCA定量方法），金属浴100 ℃变性10 min。在SDS-PAGE泳道中每孔上样10 μL，电泳1.5 h，转膜，用质量分数1%的BSA溶液封闭。一抗4 ℃孵育过夜，吸去一抗，加入二抗孵育1 h，天能凝胶成像系统显影并拍照，用Image J软件处理数据。

1.7 实验动物与饲养条件

BALB/c Nude裸小鼠，购自南京青龙山动物繁殖场，许可证号：SCXK（沪）2018-0004。饲养条件：室温22～25 ℃，相对湿度：60%±10%，自然光线，自由饮水进食，适应性饲养7 d。本实验已获得中国药科大学实验动物伦理委员会批准。

1.8 动物模型的建立及分组

分别将6×106个A549细胞皮下接种于Balb/c裸鼠的小鼠背部右侧皮下。饲养7 d后，取小鼠称体质量，随机分为5组，每组6只。第1组为模型对照组，第2组为LZFQ低剂量组（0.50 g/kg），第3组为LZFQ中剂量组（1.00 g/kg），第4组为LZFQ高剂量组（2.00 g/kg），第5组为环磷酰胺组（0.075 g/kg）。每2 d测量一次体质量，在连续14 d的灌胃喂食后，将所有小鼠处死并称其质量，解剖剥离瘤块，并称其质量。根据公式（1）计算肿瘤抑制率。

式中：

S——肿瘤抑制率，%；

C——给药组平均瘤重，g；

T——对照组平均瘤重，g。

1.9 数据统计学处理

所有的数据结果均以±s表示，采用SPSS 21.0数据处理软件行组间单因素方差分析，多组间比较行F值检验，组间对比行独立样本t检验，若p＜0.05则表示存在显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 MTT实验结果

采用MTT法对LZFQ进行了体外抗肿瘤活性测试，并以LZBZ为阳性对照，测定了它们对人非小细胞肺癌细胞（A549）、人胃癌细胞（BGC823）、人乳腺癌细胞（MCF-7）和人结肠癌细胞（HCT116）的抑制活性（表1）。结果如表1所示，相较于灵芝孢子油，LZFQ对人非小细胞肺癌细胞（IC50=0.49 mg/mL）、人乳腺癌细胞（IC50=0.53 mg/mL）和人结肠癌细胞（IC50=0.61 mg/mL）有不同程度的提高。其中LZFQ对A549细胞的IC50值为0.49 mg/mL，在四种癌细胞中抗肿瘤活性最好，因此，选取A549细胞对LZFQ进行抗肿瘤机制研究。

表1 LZFQ对4种肿瘤细胞的抗增殖作用Table 1 Antiproliferative effects of LZFQ on four tumor cells(mg/mL,±s, n=3)

注：*p＜0.05，**p＜0.01 vs A549 by LZFQ。

组别 IC50/(mg/mL)A549 BGC823 MCF-7 HCT116 LZFQ 0.49±0.02 0.58±0.04* 0.53±0.01* 0.61±0.04**LZBZ 0.54±0.03 0.56±0.04 0.58±0.05 0.66±0.03

2.2 LZFQ诱导A549细胞凋亡

为了确定LZFQ是否诱导A549细胞凋亡，在A549细胞中采用annexin V-FITC/PI双染色法来研究。如图1所示，A549细胞在不同浓度（0.125、0.25、0.50 mg/mL）的LZFQ作用48 h后，早期（annexin-V+/PI）和晚期（annexin-V+/PI+）凋亡细胞比例分别为11.20%、20.50%和25.30%。结果表明LZFQ可以浓度依赖性的诱导细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。

图1 不同浓度LZFQ对A549细胞凋亡的影响Fig.1 Effect of different concentration of LZFQ on apoptotic in A549 cell (±s, n=3)

2.3 LZFQ对凋亡相关蛋白的影响

表2 LZFQ对凋亡相关蛋白的影响Table 2 Effects of LZFQ on the apoptosis related proteins.(±s, n=3)

注：*p＜0.05；**p＜0.01 vs DMSO group。

LZFQ/(mg/mL) Ratio of apoptosis related proteins/GAPDH Bcl-2 Bax Cleaved-caspase-3 0 0.91±0.07 0.18±0.01 0.25±0.03 0.125 0.85±0.08 0.23±0.03 0.37±0.05*0.25 0.60±0.04* 0.36±0.02* 0.59±0.02**0.50 0.42±0.05** 0.44±0.04** 0.68±0.04**

下调Bcl-2（抗凋亡蛋白）水平及上调Bax（促凋亡蛋白）水平可激活凋亡通路。为进一步阐明LZFQ的促凋亡机制，测试了其对凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及Cleaved-Caspase-3的影响作用。实验结果如表2所示，随着给药浓度逐渐升高（0、0.125、0.25、0.50 mg/mL），LZFQ浓度依赖性地降低抑凋亡蛋白Bcl-2的水平（Bcl-2/GAPDH为0.91、0.85、0.60、0.42）、并提高促凋亡蛋白Bax（Bax/GAPDH为0.18、0.23、0.36、0.44）及Caspase-3（Cleaved-Caspase-3/GAPDH为0.25、0.37、0.59、0.68）的水平。本实验表明，LZFQ能够影响癌细胞中凋亡相关蛋白的水平，从而发挥诱导癌细胞凋亡的作用。

2.4 LZFQ对小鼠体内移植瘤的影响

为了评价LZFQ在体内的抗肿瘤活性，将A549细胞接种于小鼠背部右侧皮下，建立小鼠肺腺癌异种移植瘤模型。结果如表3所示，LZFQ低、中、高剂量组对A549荷瘤小鼠抑瘤率分别为43.27%、51.92%、60.58%，三种剂量组明显减小了肿瘤质量，与模型对照组相比有显著性差异（p＜0.01）。阳性对照组肿瘤显著减小，与模型对照组相比差异有统计学意义（p＜0.01）。另外，LZFQ低、中、高剂量给药荷瘤小鼠与模型组实验前后各组体重基本一致（分别为22.52、22.49和23.08 g），而环磷酰胺组体重有所降低（18.34 g），表明LZFQ对体重没有显著影响。

灵芝孢子油是从破壁的灵芝孢子中提取的脂质活性物，目前主要的提取方法包括索式提取法、超临界CO2萃取法、超声波提取法以及水酶法。灵芝孢子油富含三萜类、核苷类及部分多糖类化合物，是灵芝孢子有效成分的集合体[5,6]。随着灵芝孢子油提取工艺和方法的进步，人们对灵芝孢子油的研究日益重视和深入。现代药理研究表明，灵芝孢子油具有抗肿瘤、免疫调节、神经调节、降血脂和保肝护肝等活性[6,7]。在抗肿瘤方面，灵芝孢子油能显著诱导多种肿瘤细胞凋亡，这与其上调Bax同时下调Bcl-2和VEGF的mRNA表达水平，降低线粒体膜电位和细胞色素c的释放等关键因素有关[8-13]。番茄红素是一种天然类胡萝卜素，是由11个共轭双键和2个非共轭双键组成的直链碳氢化合物，主要存在于成熟的番茄、西瓜、番石榴、玫瑰果、木瓜和葡萄柚等果实中[14]。人体自身不能合成番茄红素，其摄入量的85%来源于番茄和以番茄为基础的产品[15]。药理研究表明，番茄红素在抗氧化、提高机体免疫力等方面具有较好的作用[16-26]，因而被广泛应用于保健品、化妆品中。

表3 LZFQ对A549荷瘤小鼠肿瘤质量的影响Table 3 Inhibitory effects of LZFQ on tumor growth in A549 tumor-bearing mice (±s, n=6)

注：与模型对照组相比*p＜0.05，**p＜0.01。

组别剂量/(g/kg) 肿瘤质量/g 平均抑瘤率/% 小鼠体质量/g模型对照组 - 1.04±0.09 - 23.16±0.14 LZFQ低剂量组 0.50 0.59±0.03** 43.27 22.52±0.19 LZFQ中剂量组 1.00 0.50±0.03** 51.92 22.49±0.23 LZFQ高剂量组 2.00 0.41±0.02** 60.58 23.08±0.21 LZBZ组 2.00 0.45±0.03** 56.73 21.27±0.17 CTX组 0.075 0.38±0.04** 63.46 18.34±0.16

体外抗肿瘤活性实验表明灵芝孢子油番茄红素复合物具有和灵芝孢子油本身类似或更好的抗肿瘤活性。体内移植瘤实验也证明，灵芝孢子油番茄红素复合物与灵芝孢子油本身一样也能够抑制体内移植瘤的生长。这可能和灵芝孢子油与番茄红素发挥协同作用有关。

3 结论

本研究表明灵芝孢子油番茄红素复合物（LZFQ）在体内外均表现出一定的抗肿瘤活性，LZFQ对A549细胞抑制活性最佳（IC50=0.49 mg/mL），优于环磷酰胺（IC50=0.51 mg/mL）。LZFQ可以通过诱导细胞凋亡来抑制肿瘤细胞，并且浓度依赖性地降低抑凋亡蛋白Bcl-2的水平并提高促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的水平。体内移植瘤实验表明，LZFQ能够抑制体内移植瘤的生长。在后续研究中，将从灵芝孢子油和番茄红素的协同作用入手，进一步深入探究二者相互作用。总的来说，本研究成果可为灵芝孢子油类复合物产品的研发提供实验依据。