神经元型钙结合蛋白2在大鼠脊髓损伤后表达及神经修复功能

徐纪伟 孙丹华 陈旭东

(漯河医学高等专科学校基础医学部，河南 漯河 462000)

钙信号不仅是生命活动中的基础信号之一，还可作为第二信使激活细胞内信号传导通路，成为生命赖以整合内环境稳态和动态的基础，在生命调节过程中发挥着重要作用。当机体处于病理状态下，钙离子通道大量开放，钙离子大量内流及“钙池”释放钙离子过度增加，导致钙稳态失衡，发生细胞钙超载现象，引起细胞毒性损伤。随着研究的深入，逐渐发展钙信号还具备与特殊结构蛋白质结合，通过多个途径的信号转导参与细胞周期调过程〔1〕。

最近发现的神经元型钙结合蛋白(NECAB)2属于钙结合蛋白超家族中的一员，钙结合蛋白超家族成员通常具有多个EF-hand保守结构，但它仅具备一个EF-hand特殊结构，因此这个钙结合能力与其他的钙结合蛋白如P物质和CB相比较弱，但正是由于它特殊的化学结构使得其功能具备一定的特异性〔2〕。NECAB2的分布相对局限，主要在睾丸、大脑和脊髓出现〔3〕，目前研究主要集中在精子发育代谢和鞭毛运动的调控及外周神经损伤后疼痛刺激信号传导机制，而关于NECAB2在中枢神经损伤后的神经递质释放、突触传递以及神经可塑性等方面如何发挥功能还不是很明确。本研究旨在观察大鼠脊髓损伤后NECAB2与Caspase-3、Syn、CGRP的共同表达情况，探讨NECAB2对神经损伤后相关信号转导的内在机制。

1 材料与方法

1.1实验动物和试剂 成年雌性SD大鼠120只，鼠龄6～8 w，体重200～220 g，由河南省实验动物中心提供(实验动物许可证：豫SCXK2017-0001)。兔抗大鼠NECAB2抗体(Proteintech Group)、小鼠抗大鼠突触素(Syn)抗体(Millipore Biotechnology)、小鼠抗大鼠降钙素基因相关肽(CGRP)抗体(Santa Cruz)、小鼠抗大鼠半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗体(Santa Cruz)、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG(北京中杉生物技术公司)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的羊抗小鼠IgG、生物素化羊抗兔IgG、亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)试剂(北京中杉生物技术公司)。

1.2实验分组及模型建立 将动物分成对照组、脊髓损伤组。实验大鼠用戊巴比妥钠(45 mg/kg)腹腔注射麻醉后俯卧位固定，以T9胸棘突为中心剪除毛发，常规消毒，正中切开皮肤，分离肌肉，显露T9-T10棘突，咬除该段椎板，暴露出脊髓，快速切断一侧脊髓至正中静脉右缘，不要损伤静脉，用生理盐水冲洗，逐层缝合伤口，按摩膀胱助排尿，室温下自然苏醒，建立脊髓半切损伤模型〔4〕。对照组大鼠只切开皮肤肌肉，暴露脊髓，但不损伤脊髓。

1.3组织标本制备 每组取10只/时点大鼠，麻醉后仰卧位固定，剪开胸腔暴露心脏，从左心室进针插入主动脉，立即用生理盐水快速灌注，等右心房流出无色清亮液体后，再注入4%多聚甲醛，大鼠僵硬后快速打开脊椎管，取损伤段上下各0.5 cm脊髓组织(对照组取相应解剖位置)，置于4%多聚甲醛固定包埋，再进行石蜡切片，片厚10 μm。

1.4检测指标

1.4.1免疫荧光染色 切片放置于室温静置30 min后进行抗原修复；切片放置于10%山羊血清中，4℃过夜；滴加NECAB2抗体(1∶200)，放置于湿盒，4℃过夜；磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗(3×5 min)，滴加FITC标记的羊抗兔IgG，4℃孵育12 h，PBS漂洗(3×5 min)，滴加甘油封片，荧光显微镜下观察拍照。

1.4.2免疫双标染色 切片滴加NECAB2抗体(1∶200)，再滴加Caspase-3抗体或Syn或CGRP抗体(1∶200)，放置于湿盒，4℃过夜；PBS漂洗(3×5 min)，再滴加FITC标记的羊抗兔IgG和TRITC标记的羊抗小鼠IgG，4℃孵育12 h，PBS漂洗(3×5 min)，滴加甘油封片，荧光显微镜下观察拍照。

1.4.3免疫印迹 每组取10只/时点大鼠，麻醉后快速打开脊椎管，收集损伤区上下各0.5 cm脊髓组织(对照组取相应解剖位置)，放置裂解液中匀浆，高速离心取上清液备用。用Bio-Rad分析蛋白浓度后，取20 μg蛋白液做十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用300 mA进行2 h蛋白质转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用脱脂牛奶封闭2 h。TBST漂洗(3×5 min)。滴加NECAB2抗体(1∶500)，4℃过夜；TBST漂洗(3×5 min)，再滴加生物素化山羊抗兔IgG(1∶500)，放置2 h，TBST漂洗(3×5 min)。再滴加ABC试剂，避光放置1 h，TBST漂洗(3×5 min)。观察结果，重复3次。

1.5统计学方法 采用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1免疫荧光 对照组在脊髓后角发现NECAB2阳性神经细胞呈现稳定表达。脊髓损伤后的1～3 d中NECAB2阳性神经细胞表达呈现逐渐降低趋势，直到脊髓损伤后7 d发现NECAB2的表达水平开始逐渐恢复，且到14 d达到高峰，之后维持在较高水平表达，但表达水平仍低于对照组。见图1、表1。

图1 术后各时间点免疫荧光检测NECAB2阳性神经细胞表达情况(×400)

表1 脊髓损伤后各时间点NECAB2阳性神经细胞数量个/视野)

2.2Western印迹 脊髓损伤组NECAB2表达在术后1～3 d出现了减少现象，术后7 d开始逐渐升高，到术后14 d达到高峰，之后维持在较高水平表达，但仍明显低于对照组(P<0.05)。对照组NECAB2呈现稳定高水平表达。见图2、表2。

2.3免疫荧光双标 脊髓损伤后14 d发现NECAB2与Syn明显共表达，NECAB2与CGRP在邻近细胞呈现互补表达，与Caspase-3不存在共表达。见图3。

图2 Western印迹检测NECAB2相对吸光度值

表2 脊髓损伤后各组各时间点NECAB2表达水平比较

图3 脊髓损伤术后14天NECAB2、CGRP、Syn、Caspase-3表达情况(×400)

3 讨 论

钙结合蛋白(CaBPs)钙结合蛋白家族包括CaM、CB、PV、CR等两百多种蛋白质，是一组具有E-Fhand保守结构的酸性蛋白超家族，可分为两种类型：一种类型是激发型，它们与钙离子结合后迅速发生扭曲变形，进而结合靶分子，调节其活性；另一种类型是缓冲型，主要参与胞内钙离子浓度的调节〔5〕。其中缓冲型钙结合蛋白又是通过两个途径发挥作用：首先，钙结合蛋白可以减少由T/L型电压敏感的钙离子通道进入细胞内的钙离子流；其次，钙结合蛋白具备EF-hand特殊结构，高亲和度结合钙离子，共同作用降低细胞内游离的钙离子浓度〔6〕。

NECABs家族有3个成员，即NECAB1、NECAB2、NECAB3，其中NECAB1主要存在于大脑、结肠、肝脏和胰腺等器官，NECAB3主要存在于大脑、心脏和骨骼肌等器官，而NECAB2的分布相对局限，主要在睾丸、大脑和脊髓出现，它能够发现细胞钙离子浓度的微小变化，去极化时高亲和力结合钙离子，维持细胞钙离子稳态〔7,8〕。

在脊髓损伤后的早期，神经组织直接遭受机械性打击破坏组织结构，导致神经细胞、神经胶质细胞及微血管床等出现损伤，细胞出现急性肿胀、细胞器崩解、结构消失，进而发生脂质过氧化损伤和细胞钙超载现象，最终引发组织细胞“瀑布式”级联损伤作用。细胞损伤过程中钙离子超载现象是最重要的一个环节，因为大量钙离子内流不仅激活凋亡蛋白酶激活因子(Apaf)-1，还能抑制凋亡抑制因子B细胞淋巴瘤(Bcl)-2活性〔9,10〕，通过蛋白激酶(PK)C和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，进而激活Caspase-3大量表达，诱导神经细胞凋亡〔11〕。Schöndorf等〔12〕研究发现通过慢病毒介导的短发夹shRNA技术敲除诱导型多能干细胞(iPSC)衍生神经元中NECAB2基因，再将iPSC衍生神经元暴露于钙镁混合载体A23187，并通过免疫染色评估神经毒性，发现咖啡因诱导的胞质钙离子水平增加，加重了神经毒性损伤，这也从侧面说明NECAB2具备钙缓冲特性。因此在脊髓损伤早期由于损伤区域存活的神经细胞较少及钙离子大量内流发生钙超载，细胞凋亡情况较为严重，导致NECAB2表达水平相对较低。

在脊髓损伤的后期，由于炎性介质的促发效应引起星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞前体细胞在损伤区域聚集，尤其是星形胶质细胞被大量活化，产生神经胶质纤维逐渐形成致密的瘢痕组织，这些瘢痕组织虽然限制了神经轴突生长，但是也同时形成了保护性屏障，将具有吞噬性能力的小胶质细胞限制在坏死核心，密封伤口并促进碎屑清除、炎症抑制，随着炎症的消退，刺激小胶质细胞向M2型极化，释放大量具有神经保护及促进轴突再生作用的脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)，逐渐修复损伤的神经组织〔13,14〕。这些原因导致脊髓损伤区域的炎症减轻，有利于神经细胞存活，同时促进NECAB2合成增加，进而反馈调节BDNF从兴奋性神经末梢的释放〔15～18〕。脊髓损伤后由于兴奋性神经递质谷氨酸仍持续从神经突起的囊泡释放，不仅激活了突触后膜上的谷氨酸受体，同时浸润在损伤部位的中性粒细胞、淋巴细胞上的腺苷A2A受体也同样被激活，在脊髓损伤后期NECAB2大量表达不仅能降低腺苷A2A受体在细胞膜上的表达，还可以稳定细胞内钙离子浓度，二者共同作用减轻氧化应激和炎症损伤，减少了细胞凋亡现象，有利于损伤区神经细胞存活，但是其整体表达仍低于正常水平，这与相关实验结果一致〔3，19，20〕。Syn是一种与神经生长、修复再生和突触重塑密切相关的蛋白，广泛存在于突触前膜中，其水平被认为是神经递质释放、神经元之间突触强度的重要指标，通过其磷酸化与突触囊泡解离，允许神经递质的胞吐，而NECAB2也具备调节神经突起囊泡胞吐神经递质的作用，它们共同表达的量和密度分布可作为反映神经功能的特异标志物〔21～23〕。CGRP可通过抑制兴奋性谷氨酸的释放，阻止谷氨酸介导的细胞钙离子内流，降低细胞膜钙离子的通透性，从而维持细胞内钙离子的稳定，调节Bcl-2和c-fos等基因的表达〔24,25〕，促进睫状神经营养因子(CNTF)的释放，增强转录激活子3的活性，促进生长相关蛋白(GAP)-43大量表达，提高再生基因蛋白(Reg)的水平，有利于神经细胞再生修复〔26,27〕，而NECAB2与CGRP在邻近细胞呈现互补表达，这说明NECAB2神经细胞可以与释放CGRP肽能的神经纤维构成突触，进而调节神经突触的谷氨酸转运平衡，以免过度释放大量谷氨酸造成兴奋性中毒，有利于神经细胞传递信息。

脊髓损伤后NECAB2通过调节细胞内钙离子浓度维持钙稳态，与Syn共同促进神经突起囊泡胞吐BDNF，与CGRP共同稳定神经突触内的谷氨酸转运平衡，抑制氧化应激和炎症损伤，减少神经细胞凋亡现象，在神经递质释放、突触传递及神经可塑性等方面发挥重要作用。