添加葡萄籽单宁对橡木桶陈酿‘赤霞珠’和‘马瑟兰’干红葡萄酒香气的影响

白晓璇，凌梦琪，陈柏年，兰义宾，成池芳，段长青，石 英,*

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，葡萄与葡萄酒研究中心，北京 100083；2.农业农村部葡萄酒加工重点实验室，北京 100083；3.新疆中信国安葡萄酒业有限公司，新疆 玛纳斯 832200）

葡萄酒香气是葡萄酒感官品质的重要指标之一，其香气成分的种类、含量及平衡关系的差异使葡萄酒表现出不同的风格特点。葡萄原料、发酵过程、陈酿工艺和稳定灌装等各个环节都影响着葡萄酒的香气品质。橡木桶陈酿工艺作为优质干红葡萄酒生产不可或缺的重要工艺环节，一方面使橡木中的内酯、呋喃、酚醛和挥发性酚等香气组分持续浸出到酒中，赋予葡萄酒复杂的陈酿香气，使葡萄酒香气更加协调丰富，另一方面橡木桶提供的微氧环境影响着葡萄酒中香气物质的演变规律。酚类物质具有较高的抗氧化活性，是葡萄酒中重要的基质组分，也是决定干红葡萄酒陈酿潜力的要素之一。

在葡萄酒酿造过程中，可以通过外源添加酚类物质调节葡萄酒的抗氧化特性，提高葡萄酒的品质。目前从葡萄中提取的单宁已经成为应用广泛的外源添加物，主要用于葡萄酒的颜色稳定和口感调节。例如，Paissoni等发现浸渍前添加葡萄皮单宁能够提升‘赤霞珠’和‘美乐’葡萄酒的颜色强度，且有助于聚合色素的形成。王文璇等指出在‘赤霞珠’葡萄酒酒精发酵前添加200 mg/L的单宁可以改善葡萄酒陈酿后的色泽稳定性。Harbertson等证实向‘赤霞珠’和‘美乐’葡萄酒中添加单宁，明显增强了葡萄酒的涩感。

然而关于外加单宁对葡萄酒香气影响的研究较少且研究结论不尽相同。Li Lingxi等向不同年份的‘美乐’葡萄酒中添加不同种类的单宁，结果表明添加单宁的葡萄酒香气感官得分更高。但是Villamor等发现外加单宁的作用效果与添加浓度相关，高浓度的单宁会降低香气物质挥发性，造成香气失衡。Díaz-Plaza等向‘莫纳斯特雷尔’葡萄酒中分别添加商业单宁和压榨汁后进行橡木桶陈酿，发现单宁对葡萄酒橡木来源香气物质的影响因橡木桶产地而异，添加单宁后，在美国橡木桶陈酿的酒中糠醛和4-乙基苯酚含量显著增加，而法国橡木桶陈酿的酒中2 种物质含量无明显变化。

因此，本研究旨在探究橡木桶陈酿前添加葡萄籽单宁对陈酿型干红葡萄酒香气的影响。采用顶空固相微萃取（head space-solid phase microextraction，HS-SPME）和液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）与气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用的方法，结合正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminate analysis，OPLS-DA）等统计方法，分析橡木桶陈酿前添加葡萄籽单宁（200 mg/L）的‘赤霞珠’和‘马瑟兰’干红葡萄酒中非橡木来源和橡木来源香气物质的变化差异，以及对应的感官特征强度，以期为橡木桶陈酿过程外源添加单宁调控葡萄酒品质提供理论依据和生产实践指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验样品来自于新疆玛纳斯产区中信国安葡萄酒业有限公司2018年酿造的‘赤霞珠’（Cabernet Sauvignon）和‘马瑟兰’（Marselan）干红葡萄酒，两款干红葡萄酒均采用成熟度良好的葡萄以工业化葡萄酒酿造方式进行酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵，发酵结束后分别采用中度烘烤的法国圣哥安橡木桶（T1）和轻度长时间烘烤的法国哈杜橡木桶（T2）进行陈酿，陈酿周期为12 个月。每个品种葡萄酒均设置陈酿前添加200 mg/L葡萄籽单宁（购自英纳帝斯公司）的处理组和不添加单宁的对照组，并设置2 个重复。橡木桶陈酿温度控制在14～16 ℃之间，相对湿度控制在65%～75%之间。分别在陈酿初始点第0个月、陈酿6 个月和12 个月取样分析。入桶前的葡萄酒基本理化指标见表1。

表1 入桶前葡萄酒基本理化指标Table 1 Physicochemical indexes of wine samples before barrel aging

氯化钠（优级纯）、硫酸铵（分析纯）、无水硫酸钠 上海麦克林生化科技有限公司；乙醇（色谱纯）、二氯甲烷 美国Honeywell公司；标准品 美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

7890A-5975C GC-MS联用仪、HP-INNOWax色谱柱（60 m×0.25 nm，0.25 μm） 美国安捷伦科技有限公司；CTC CombiPAL autosampler多功能自动进样器瑞士思特斯分析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酒中非橡木来源香气物质测定

利用HS-SPME-GC-MS对葡萄酒中酯类、醇类、脂肪酸类、类异戊二烯等非橡木来源挥发性香气物质进行测定。将5 mL葡萄酒样品、10 μL内标（4-甲基-2-戊醇，0.989 8 g/L）和1.5 g氯化钠于20 mL顶空瓶中，40 ℃平衡30 min后用50/30 μm 2 cm聚二甲基硅氧烷/碳分子筛/二乙烯苯萃取头吸附30 min。每个样品做2 个独立重复。

GC条件：进样口温度250 ℃，5∶1分流模式进样，热解吸时间8 min。升温模式为50 ℃保持1 min，3 ℃/min升温至220 ℃保持5 min。

MS条件：电子电离源；离子源温度230 ℃；质谱接口温度250 ℃；离子能70 eV；四极杆温度150 ℃；采用全离子扫描模式，质量扫描范围为29～350 u。

1.3.2 葡萄酒中橡木来源香气物质测定

利用LLE-GC-MS对葡萄酒中呋喃类、酚醛类、挥发性酚类及橡木内酯共4 类橡木来源挥发性香气物质进行测定。将20 mL葡萄酒样、10 μL混合内标（4 g/L-己内酯、2 g/L 3,4-二甲基苯酚、4 g/L-香草醛）和5 g硫酸铵于50 mL离心管中。加入5 mL二氯甲烷，振荡5 min后离心（4 ℃、10 000 r/min、10 min）。收集下层二氯甲烷溶液。加入5 mL二氯甲烷重复上述提取操作。将2 次离心收集到的二氯甲烷溶液加入1.5 g无水硫酸钠除水，氮吹浓缩至1 mL。浓缩后的液体经0.22 μm有机系微孔过滤膜过滤至2 mL进样小瓶中。每个样品做2 个独立重复。

GC条件：进样口温度250 ℃，1 μL不分流进样。升温模式为50 ℃，以7 ℃/min升温至120 ℃，保持5 min，以2 ℃/min升温至200 ℃/min，然后以10 ℃/min升温至240 ℃，保持20 min。

MS条件同1.3.1节。

1.3.3 定性与定量分析

利用自动质谱退卷积定性系统（automated mass spectral deconvolution and identification system，AMDIS）解谱，将峰质谱图与标准品以及NIST 2011标准谱库的质谱信息进行匹配，并计算每个香气物质的保留指数（retention index，RI），对化合物进行定性。

采用内标-标准曲线法进行定量分析。以乙醇溶液（13%，/）为基质配制模拟酒溶液（2 g/L葡萄糖，7 g/L酒石酸，pH 3.5），通过加入香气物质标准品梯度稀释10 个浓度梯度的标准品溶液，分别采用1.3.1节和1.3.2节方法对非橡木来源和橡木来源香气物质进行测定。计算目标化合物峰面积与内标物峰面积的比值，利用峰面积比值和物质浓度呈正比的关系，绘制各物质的标准曲线后进行定量。其中非橡木来源挥发性香气物质以4-甲基-2-戊醇为内标，橡木来源香气物质中呋喃类和橡木内酯以-己内酯为内标，挥发性酚类物质以3,4-二甲基苯酚为内标，酚醛类物质以-香草醛为内标。

1.3.4 香气感官分析

参照GB/T 12315—2008《感官分析 方法学 排序法》对葡萄酒各香气特征进行感官特征强度排序。12 名品评成员（3 男，9 女，年龄在20～27 岁之间）来自葡萄与葡萄酒研究中心感官小组，在进行正式品评前每位小组成员均进行了香气培训，涉及葡萄酒各类香气的识别、分类和强度评级。感官实验在专业品评室进行，要求品评员对酒样中特定的香气特征强度进行排序。在2 个桶型陈酿的葡萄酒分2 次进行感官实验。实验完成后，计算同一样品同一特征的秩次总和（秩和），利用Friedman检验对排序结果进行样品间的差异显著性分析，用最小显著性差异（least significant difference，LSD）值进行多重比较。

1.4 数据处理

通过Microsoft Excel进行数据预处理，OPLS-DA通过软件SIMCA 14.1进行，使用IBM SPSS Statistics 20对数据进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 葡萄籽单宁添加对葡萄酒香气物质的影响

通过HS-SPME-GC-MS定量58 种挥发性香气物质，包括酯类物质25 种、高级醇类物质20 种，脂肪酸类物质5 种，类异戊二烯6 种，以及其他物质2 种。这些香气物质主要来源于葡萄果实以及在发酵过程中产生。通过LLE-GC-MS定量了主要来源于橡木桶陈酿过程的22 种挥发性香气物质，其中呋喃类物质及其衍生物5 种，酚醛类物质及其衍生物6 种，挥发性酚类物质9 种以及橡木内酯类物质2 种。分别以第12个月出桶点‘赤霞珠’和‘马瑟兰’2 种葡萄酒中定量的80 种香气物质的质量浓度为变量建立OPLS-DA模型（图1）。

图1 桶储12 个月葡萄酒中香气物质OPLS-DAFig. 1 OPLS-DA of aroma compounds in wines aged in barrels for 12 months

变量投影重要度（variable importance for the projection，VIP）值大于1的物质是在OPLS-DA中对分类起关键作用的变量，将其在载荷图中标注出名称。由图1B可知，‘赤霞珠’葡萄酒的关键物质共有26 种，包括8 种高级醇、4 种脂肪酸、1 种乙酯、2 种类异戊二烯及11 种橡木来源香气物质。其中橡木来源香气物质主要集中在添加葡萄籽单宁的处理组（ST），即添加葡萄籽单宁后橡木来源香气物质含量较未添加葡萄籽单宁更高。由图1D可知，‘马瑟兰’葡萄酒的关键物质共有24 种，包括4 种高级醇、3 种脂肪酸、6 种类异戊二烯、1 种乙酯、苯乙醛和9 种橡木来源香气物质，这些物质大多集中在未添加葡萄籽单宁的对照组，综上所述，葡萄籽单宁添加会对陈酿后葡萄酒香气的影响因酒的类型不同而存在明显差异。

2.2 葡萄籽单宁添加后差异香气物质分析

为进一步明确陈酿前葡萄籽单宁添加影响的差异香气物质，结合OPLS-DA中VIP值大于1的物质，将第12个月至少在一个桶型的对照组和处理组物质质量浓度存在显著差异的挥发性香气物质（＜0.05）列出，同时列出这些差异香气物质在陈酿6 个月时的分析结果（表2、3）。

‘赤霞珠’葡萄酒的差异香气物质包括8 种橡木来源香气物质和2 种非橡木来源香气物质。其中糠醛、糠醇和乙酰呋喃是橡木桶陈酿葡萄酒中重要的呋喃类物质，主要带来烤面包、焦糖和烧焦等香气。香草醛及香草酸乙酯是重要的酚醛类物质，具有典型的香草香气特征。紫丁香酚会带来烟熏、烤肉等香气。由表2可知，在第12个月的处理组中，8 种橡木来源的差异香气物质的质量浓度均高于对照组，且至少有一个桶型存在显著性差异。在第6个月这些橡木来源香气物质除香草醛（ST2）外也在处理组中质量浓度更高，且有5 种香气物质差异显著。表明在‘赤霞珠’葡萄酒中葡萄籽单宁的添加有助于橡木来源香气物质的浸出，并随陈酿时间的延长而加强。对于非橡木来源香气物质，在第12个月时，正癸酸在处理组中质量浓度更高，癸醇在处理组中质量浓度更低，且二者都在T1存在显著差异。

表2 ‘赤霞珠’葡萄酒差异香气物质质量浓度Table 2 Concentrations of differential aroma compounds in Cabernet Sauvignon wine μg/L

‘马瑟兰’葡萄酒的差异香气物质包括5 种橡木来源香气物质和9 种非橡木来源香气物质。其中5-甲基糠醛和5-羟甲基糠醛会为葡萄酒带来烘烤及烤杏仁的香气。由表3可知，在第12个月的处理组中，橡木来源的差异香气物质质量浓度均低于对照组，且糠醛、5-甲基糠醛、乙酰呋喃和5-羟甲基糠醛的质量浓度在2 个桶型的陈酿实验都差异显著，这些橡木来源香气物质在第6个月均在处理组中质量浓度更低，且至少一个桶型存在显著性差异。对于非橡木来源香气物质，处理组中的-月桂烯、对伞花烃、异丁醇、香茅醇的质量浓度略低于对照组，且在第12个月至少有一个桶型差异显著。其余非橡木来源香气物质在处理组ST2中质量浓度更低且有显著性差异，在处理组ST1中质量浓度略高但差异不显著。在第6个月除香茅醇其余非橡木来源香气物质质量浓度差异不显著。

表3 ‘马瑟兰’葡萄酒差异香气物质质量浓度Table 3 Concentrations of differential aroma compounds in Marselan wine μg/L

以上结果表明，‘赤霞珠’和‘马瑟兰’葡萄酒受到葡萄籽单宁添加影响的差异香气物质种类存在异同。‘赤霞珠’葡萄酒的橡木来源差异香气物质种类更多，‘马瑟兰’葡萄酒的非橡木来源差异香气物质种类更多，这是因为不同干红葡萄酒在陈酿过程中香气物质的变化不同。正如Baiano等的研究中，将‘艾格尼科’和‘蒙特布查诺’干红葡萄酒在同样的陈酿条件下进行陈酿，发现2 种酒的花色苷、单宁和香气成分变化都有不同。将‘赤霞珠’和‘美乐’葡萄酒进行橡木桶陈酿，发现‘美乐’酒中橡木来源香气提取率更高。葡萄酒中酒精含量、酚类物质和多糖等众多基质成分也影响葡萄酒中的香气。

结合对照组与处理组的差异香气物质在陈酿过程中质量浓度的变化量可知（大于0即香气物质在陈酿过程中含量增加），在0～6 个月，‘赤霞珠’葡萄酒中橡木来源的差异香气物质含量在处理组中增加幅度更大，且这一现象在2 种桶型中表现一致（表4）。在6～12 个月，糠醇、香草醛和紫丁香酚在所有酒中质量浓度均增加，且在处理组中增加幅度更大。尽管在6 ～12 个月，部分差异香气物质的质量浓度下降，但经过12 个月的陈酿后，所有橡木来源差异香气物质及正癸酸相较于0 个月质量浓度均增加。同时受到桶型的影响，香气物质在2 种桶型的陈酿实验中含量增加幅度有差异，这可能是由于陈酿过程中葡萄酒橡木来源香气会受到橡木板材的品种和烘烤程度等多个因素的影响所致。癸醇在陈酿过程中呈现波动，但在第12个月处理组中癸醇质量浓度均更低（表2）。结果表明，添加葡萄籽单宁后，在‘赤霞珠’葡萄酒的陈酿过程中橡木来源差异香气物质和正癸酸含量增加幅度更大，且这一趋势在0～6 个月已经体现。

表4 ‘赤霞珠’葡萄酒差异香气物质在陈酿过程中质量浓度变化量Table 4 Variation in concentrations of differential aroma compounds in Cabernet Sauvignon wine during aging μg/L

由表5可知，在0～6 个月，‘马瑟兰’葡萄酒中橡木来源差异香气物质在处理组中质量浓度增加幅度更小，且这一现象在2 种桶型中表现一致。非橡木来源香气物质-萜品醇和里那醇也在处理组中质量浓度增加幅度更小。在6～12 个月，乙酰呋喃和对伞花烃在所有酒中质量浓度均增加，且在处理组中增加幅度更小。与‘赤霞珠’葡萄酒相同，‘马瑟兰’葡萄酒中部分香气物质在陈酿过程中质量浓度下降，但经过12 个月的陈酿，所有橡木来源差异香气物质相较于0 个月质量浓度均增加，且受到桶型的影响，香气物质在2 种桶型的陈酿实验中含量增加幅度和变化趋势有差异。尽管-月桂烯、对伞花烃、香茅醇和异丁醇在陈酿过程中反应复杂且含量变化趋势不稳定，但这几种非橡木来源香气物质在第12个月都是处理组质量浓度更低，说明添加葡萄籽单宁后‘马瑟兰’葡萄酒中部分非橡木来源差异香气物质受到抑制，同时陈酿过程中橡木来源的差异香气物质含量变化幅度更小，酒体香气表现较为稳定。

表5 ‘马瑟兰’葡萄酒差异香气物质在陈酿过程中质量浓度变化量Table 5 Variation in concentrations of differential aroma compounds in Marselan wine during aging μg/L

橡木桶陈酿前葡萄籽单宁的添加对‘赤霞珠’和‘马瑟兰’干红葡萄酒香气物质的影响有差异，可能与2 种葡萄酒的基质成分差异有关。在葡萄酒陈酿过程中，以酚类物质和香气物质为代表的葡萄酒基质成分会发生一系列复杂的反应。一方面在橡木桶陈酿过程中，橡木来源的香气物质能够和酚类物质发生反应，比如呋喃醛和一些酚醛能够介导黄烷醇之间和黄烷醇与花色苷之间醛基桥联的聚合反应，生成低聚物；其次，酚类物质由于存在苯环及多羟基的结构会与香气物质之间发生π-π共轭、疏水键或氢键等相互作用；另外，酚类物质的组成和含量会改变陈酿过程中葡萄酒的氧化还原电势，进而调节香气物质的演变。这些反应都可能是葡萄籽单宁影响葡萄酒香气物质含量的深层次原因。

2.3 葡萄籽单宁添加对葡萄酒香气感官的影响

采用感官分析排序法分别对2 个桶型陈酿12 个月出桶后的‘赤霞珠’和‘马瑟兰’葡萄酒的各个香气感官特征进行评价，秩和越小，表示该感官特征强度越强，反之越弱（表6）。结果表明，对于同一品种在不同桶型中陈酿的葡萄酒，添加葡萄籽单宁降低了‘赤霞珠’葡萄酒生青味和浆果香的香气感知，增强烘烤香，这可能是由于糠醛、糠醇等橡木来源香气物质含量的增加。浆果香强度的降低可能是由于葡萄酒中烘烤类香气对果香感知有一定掩盖作用。在‘马瑟兰’葡萄酒中，添加葡萄籽单宁后生青味和花香的香气感知略有增强。但是在感官排序结果中，T1的结果差异不显著，所以同一品种葡萄酒在不同桶型中感官特征存在差异。对于同一桶型中陈酿的不同品种的葡萄酒，结合LSD多重比较结果，与马瑟兰处理组（ST2）相比，赤霞珠处理组（ST2）的橡木味显著高且浆果香显著低，这表明在同一桶型中葡萄酒种类的差异也会影响橡木桶陈酿香气的感官表达。

表6 陈酿结束后‘赤霞珠’、‘马瑟兰’葡萄酒感官排序结果Table 6 Sensory ranking results of Cabernet Sauvignon and Marselan wines after aging

3 结 论

采用HS-SPME和LLE结合GC-MS分析方法，以‘赤霞珠’和‘马瑟兰’干红葡萄酒为研究对象，分析了陈酿前添加葡萄籽单宁后葡萄酒香气物质质量浓度和香气感官特征强度的差异。对于‘赤霞珠’葡萄酒，添加葡萄籽单宁会促进橡木来源香气物质糠醛、乙酰呋喃、糠醇、香草酸、4-乙基愈创木酚、香草醛、香草酸乙酯和紫丁香酚的浸出以及非橡木来源香气物质正癸酸的增加。相反，对于‘马瑟兰’葡萄酒，添加葡萄籽单宁会抑制橡木来源香气物质糠醛、乙酰呋喃、糠醇、5-甲基糠醛和5-羟甲基糠醛的浸出，同时还会降低部分非橡木来源香气物质含量。结合感官实验结果，橡木桶陈酿前添加葡萄籽单宁，‘赤霞珠’干红葡萄酒的生青味和浆果香减弱，烘烤味增强，‘马瑟兰’葡萄酒的生青味和花香略有增强。结果表明，葡萄籽单宁的添加主要影响了橡木来源香气物质的质量浓度，但对于不同类型葡萄酒的影响可能由于葡萄酒本身基质组分的不同而存在差异。因此，橡木桶陈酿前葡萄籽单宁的选择和添加量需要根据葡萄酒具体特性决定。葡萄酒橡木桶陈酿过程中单宁影响香气的内在机理有待进一步探究。