高效液相色谱法测定饲料中的枯草菌肽

单慧燕，刘丽芳，史彦薇，黄好强，向霞霞，兰尊海

(1.河南海瑞正检测技术有限公司，河南 郑州 450001；2.郑州赛科药业科技有限公司，河南 郑州 450003)

抗生素作为促生长添加剂，可提高动物的生产性能和养殖效益[1]，但是随着抗生素的广泛使用，其耐药性和药物残留等负面作用越来越突出。《中华人民共和国农业农村部公告 第194号》规定，自2020年1月起，退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种，自2020年7月1日起，饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料[2]。寻找抗生素的替代品，开发安全性好、无药物残留、无副作用的药物添加剂具有重要意义。

枯草菌肽主要作用于革兰氏阳性细菌和阴性球菌，对螺旋体也有较好的抑制作用，可作为一种新型的抗生素替代品。枯草菌肽为类白色或淡黄色的粉末，无臭、味苦，有引湿性，易被氧化剂破坏，在溶液中能被多种重金属盐类沉淀[3]。枯草菌肽在水中易溶，亦可溶于乙醇，不溶于丙酮、氯仿或乙醚。目前枯草菌肽的检测方法主要有液质联用法[4-6]和微生物法[7]。液质联用法受基质的干扰，存在回收率低、离子选择性差等问题。微生物法受菌株稳定性的影响，检测结果不易控制，而且所需的菌株价格较高。本试验采用高效液相色谱法测定饲料中枯草菌肽的含量。

1 材料与方法

1.1 仪器设备、试剂与供试品

1.1.1 仪器设备

e2695高效液相色谱仪(Waters)配紫外检测器，购自沃特世科技(上海)有限公司。BSA124分析天平购自赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。KQ-250DE型数控超声波清洗器购自昆山市超声仪器有限公司。JW-2019HR高速冷冻离心机购自安徽嘉文仪器装备有限公司。HSC-248氮吹仪购自天津市恒奥科技发展有限公司。1820V超纯水机购自重庆摩尔水处理设备有限公司。

1.1.2 试剂

枯草菌肽标准品(TMstandard)。色谱级三氟乙酸(上海沪试精细化学品有限公司)。色谱级乙腈(天津彪仕奇科技发展有限公司)。

流动相 A(0.1%三氟乙酸)：取1 mL三氟乙酸，用超纯水定容至1000 mL，用0.22 μm滤膜过滤，超声脱气10 min 后密封保存。流动相B(80%乙腈)：量取800 mL乙腈，加超纯水定容至1000 mL。用移液器取0.85 mL三氟乙酸，加入到乙腈-水溶液中，用0.22 μm滤膜过滤，超声脱气10 min后密封保存。

1.1.3 供试品

阳性饲料样品为客户委托的含枯草菌肽的饲料添加剂样品，阴性饲料样品为相同基质的不含枯草菌肽的饲料添加剂样品。

1.2 分析步骤

1.2.1 标准系列溶液配制

准确称取0.2 g枯草菌肽标准品，置于100 mL容量瓶中，加入约70 mL的蒸馏水，超声处理20～30 min，取出，放至室温，用蒸馏水定容，得到质量浓度为2.0 mg/mL的标准储备液。分别吸取0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 mL标准储备液置于10 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，得到质量浓度为0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/mL的标准系列溶液，分别吸取标准系列溶液于进样瓶中，上机测定。

1.2.2 饲料样品溶液配制

准确称取阳性饲料样品5.0 g，置于100 mL容量瓶中，加入约70 mL的蒸馏水，超声处理20～30 min，取出，放至室温，用蒸馏水定容。用0.22 μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液1 mL，接滤液于进样瓶中，上机测定。

1.3 仪器条件

色谱柱：C8色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相A和流动相B梯度洗脱(0～15 min时70∶30，16～25 min时57∶43，26～30 min时0∶100，31～35 min时70∶30)；流速为1.0 mL/min。检测波长为280 nm。进样量为20 μL。柱温为25 ℃。

1.4 结果计算

饲料样品中枯草菌肽的含量按下列公式进行计算：

式中:

X—样品中枯草菌肽的含量，单位为mg/kg；

C—根据标准曲线计算出样品溶液中枯草菌肽的质量浓度，单位为mg/mL；

m—样品称样量，单位为g；

V—样品的定容体积，单位为mL；

F—样品的稀释倍数。

2 结果

2.1 线性方程拟合

吸取标准系列溶液约1 mL，过0.45 μm微孔滤膜，过滤液按照1.3项中色谱条件进样检测，记录目标峰的峰面积(表1)。以枯草菌肽的质量浓度为自变量，以目标峰峰面积为因变量，拟合的线性方程为y=1 827 919.4x-33 109.6，R2=0.999 1。

表1 标准溶液质量浓度和目标峰峰面积

2.2 精密度试验

吸取0.5 mg/mL的标准溶液1 mL，过0.45 μm微孔滤膜，过滤液进样检测，重复进样6次，记录枯草菌肽的保留时间和峰面积值(表2)，二者的相对标准偏差(RSD)分别为0.59%和1.64%。

表2 精密度试验结果

2.3 检出限试验

吸取质量浓度为0.1 mg/mL的标准溶液。依次稀释成质量浓度为0.1、0.01、0.005、0.0025 mg/mL的溶液。按1.3项中色谱条件依次进样检测，计算信噪比(表3)。取信噪比≥3时的质量浓度为最低检出限[8]，最低检出限为0.005 mg/mL。

表3 检出限试验结果

2.4 重现性试验

称取适量的阳性饲料样品，配制成质量浓度约为0.5 mg/mL的供试品溶液，6份。取溶液约1 mL，过0.45 μm微孔滤膜。进样两针，记录色谱图峰面积，根据线性方程计算得出溶液中枯草菌肽的质量浓度，并计算出RSD值(表4)。

表4 重现性试验结果

2.5 回收率试验

称取阴性饲料样品作为本底样品，分别添加0.20、0.50、1.00 mg/mL 三个不同质量浓度的枯草菌肽标准溶液。按照1.2～1.4的方法进行试验，平行测定2次，计算出回收率，结果显示回收率为93.0%～99.8%(表5)。

表5 回收率试验结果

3 讨论

枯草菌肽易溶于水，所以选择蒸馏水作为提取溶剂。仪器条件的选择参考了杨彩霞的方法[9]。

本试验从线性方程拟合、精密度、重现性和回收率等方面对方法的合理性进行验证。将标准溶液梯度稀释，上机分析，以质量浓度-峰面积拟合方程的相关系数为0.999 1。将阳性饲料样品配制成一定质量浓度的溶液进行测试，发现目标峰保留时间和峰面积的RSD值均较低。称取阴性饲料样品作为本底样品，分别添加0.20、0.50、1.00 mg/mL 三个不同质量浓度的枯草菌肽标准溶液，检测结果显示，三个不同质量浓度溶液的回收率均较高。上述试验结果表明，高效液相色谱方法适用于饲料中枯草菌肽含量的测定，该方法成本低、操作简便、重现性好、精确度和灵敏度高。