UPLC/MS/MS法测定食用油中12种增香剂的含量*

林浩学

(福建省产品质量检验研究院，福建 福州 350001)

在大众的平日生活中，中国人觉得食用油是不可或缺一种食材，几乎每一餐都离不开它。食用油的质量安全水平关乎普罗大众的身体健康，某些不法食用油生产厂家往往为了取得更多的利润，经常在食用油的生产过程中添加非法香料以改变或提高油脂的香味，从而欺瞒消费者。麦芽酚类、香兰素类以及香豆素类常见的香味增效剂因其价格低廉，增味效果好，常被不法商家用来以次充好[1-9]。因此近年来国家有发布一些关于食品安全的政策，对香味增效剂的加添进行了管控；在市场上在食用油中非法添加香味增效剂的事件也时有报道[10-14]。目前的科研实验中，并未有对食用油中几种增香剂的同时测定，所以有必要建立一种高效、快速、准确的香兰素类、麦芽酚类、香豆素类添加剂检测方法为食用油类食品安全质量提供技术支持。由于食品添加剂的用量属于微量范围，本次实验可以采用超高效液相色谱串联质谱法测定食用油中香豆素、麦芽酚、香兰素类添加剂的含量。目前国内外的检测实验中，使用的检测方法有高效液相色谱法、高效液相色谱串联质谱法、气相色谱法、气相色谱串联质谱法、表面增强拉曼光谱法等[15-22]，测定各类食品中的麦芽酚、香兰素、香兰素类非法添加剂。实验结果大多具有良好的线性关系和回收率。

1 仪器与试药

1.1 仪 器

Agilent1290-AB5500型超高效液相色谱-串联质谱仪，Agilent公司- AB SCIEX公司；Auto EVA 60位全自动平行浓缩仪，Reeko公司；DTC-27J超声波清洗机，鼎泰(湖北)生化科技设备制造有限公司；Heraeus Multifug X3R高速冷冻离心机，塞默飞世尔科技(中国)有限公司；HandyStep ELECTRONIC全自动电子移液器，塞默飞世尔科技(中国)有限公司；MS 3涡旋混合器，IKA公司。

1.2 试 剂

12种食品增香剂标准品：乙基麦芽酚(含量：99.70%)，上海ANPEL实验科技股份有限公司；香兰素(含量：99.90%)，BE PURE公司；甲基香兰素(含量：98.76%)，STANFORD CHEMICALS公司；乙基香兰素(含量：98.81%)，STANFORD CHEMICALS公司；香豆素(含量：99.90%)，BE PURE公司；7-甲氧基香豆素(含量：97.70%)，FIRST STANDARD公司；二氢香豆素(含量：99.90%)，上海ANPEL实验科技股份有限公司；7-甲基香豆素(含量：99.40%)，LGC DR公司；7-乙氧基-4-甲基香豆素(含量：99.60%)，LGC DR公司；醋硝香豆素(含量：99.70%)，LGC DR公司；环香豆素(含量：100 μg/mL)，FIRST STANDARD公司；7-二乙胺香豆素(含量：99.00%)，PANPHY公司；12种增香剂标准品结构简式见图1。

图1 12种增香剂标准品的结构简式

甲醇、乙腈、乙酸(色谱纯)，山东禹王和天下新材料有限公司；正己烷、氯化钠(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司。

1.3 试验材料

山茶油、大豆油、菜籽油、辣椒油、花椒油、橄榄油、花生油7种基质样品共50份。

2 试验方法

2.1 前处理方法

称取1 g样品(准确至0.01 g)，置于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋振荡10 min，加入3 g氯化钠，超声10 min，4500 rpm离心后取上层清液2 mL于5 mL刻度管中，加入2 mL乙腈饱和正己烷进行净化处理，涡旋混合30 s，静置分层后，弃置上层正己烷层，取下层乙腈清液过0.22 μm滤膜，待分析。

2.2 色谱条件

色谱柱：Waters BECH C18色谱柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)；流速：0.3 mL/min；柱温：30 °C；进样量：2 μL；洗脱液组分为两种溶液，A为0.3%甲酸溶液，B为乙腈；梯度洗脱程序：0～5 min, 10%B～90%B; 5～7.5 min, 90%B; 7.5～8 min，90%B～10%B; 8～10 min，10%B。

2.3 质谱条件

离子源：电喷雾离子化正离子模式；雾化气温度：400 ℃; 雾化气流速：3 L/min; 喷雾气压力：45 psi；毛细管电压：5500 V；多反应监测扫描，采集参数见表1。

表1 12种化合物超高效液相串联质谱分析参数

续表1

3 结果与讨论

3.1 流动相的优化

在超高效液相色谱-串联质谱联用仪的流动相的选择使用时，乙酸铵通常用来改善化合物的峰型，在正离子模式下，甲酸可以促进目标化合物电离。因此本实验采用乙酸铵水(2 mM)溶液-乙腈和甲酸水(0.3%)溶液-乙腈两种流动相体系对12种化合物分离效果和响应值进行比较。实验表明，两种体系都能使12种化合物得到良好的分离，两种体系中12种化合物的峰型没有明显的差别；但是从响应值来看，在甲酸水(0.3%)溶液-乙腈流动相体系中12种化合物的响应要优于乙酸铵水(2 mM)溶液-乙腈(见图2，图3)，尤其是香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素三种化合物的响应值和信噪比要远优于乙酸铵水(2 mM)溶液-乙腈体系，因此选择甲酸水体系作为流动相。

图2 乙酸铵/水-乙腈体系下12种化合物的总流离子图

图3 甲酸/水-乙腈体系下12种化合物的总流离子图

3.2 质谱条件的优化

以针泵注射的方式将0.2 μg/mL 12种化合物单标分别注入质谱仪中，以正离子模式进行Q1扫描，得到母离子信息；并对其进行MRM扫描，得到各个化合物的碎片离子信息；选取响应值最高、干扰最小的离子作为定量离子，选取响应值次高的离子作为辅助定性离子；进一步优化去簇电压(DP)和碰撞能量(CE)以及电喷雾电压、雾化气流量等参数。12种化合物的二级质谱图(见图4所示)。

图4 12种化合物的二级质谱图

3.3 提取溶剂的选择

考虑到乙基麦芽酚及香兰素类化合物都有酚羟基，香豆素类化合物都有香豆内酯结构，且这几种化合物都易溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯等极性有机溶剂，分别考察乙腈、甲醇提取效果。结果表明，这两种有机溶剂对12种增香剂的提取回收率没有显著差异(见图5所示)。但在杂质去除方面，油脂类样品中某些物质(例如甾醇、磷脂等)更容易被甲醇溶解提取，难以进行后续的样品除杂净化。因此选择乙腈作为提取溶剂。

图5 不同前处理方式对12种化合物回收率影响

3.4 净化方式的选择

比较了液液萃取-净化与固相萃取-净化的前处理方式，比较两种方法的回收率差异。液液萃取-净化实验的部分，使用乙腈饱和正己烷对提取液进行净化(具体步骤见2.3)；固相萃取-净化选用HLB柱进行净化。结果表明，使用乙腈饱和正己烷净化的提取回收率要优于使用HLB固相萃取小柱净化的提取回收率(图5)。这可能是由于12种增香剂饱和蒸汽压都较低，挥发性较强；而且在固相萃取使用HLB小柱净化提取液时，存在两次的氮吹步骤，在氮吹的过程中，目标化合物被氮气流带走，逃逸至空气中造成回收率下降。而液液萃取直接利用已经饱和正己烷净化的过程中省取去了氮吹的步骤，可以很好地规避目标化合物因氮吹导致的损失，因此采用乙腈饱和正己烷净化。

3.5 分析方法的评价

3.5.1 方法的线性方程、相关系数以及线性范围

表2 12种化合物的线性方程、相关系数及线性范围

在设定的分析条件下，以峰面积(Y)为纵坐标，质量浓度(X，ng/mL)绘制标准工作曲线，按外标法计算目标化合物的含量。线性方程、相关系数及线性范围见表2。由(见表2)可知，12种化合物在设定浓度范围内线性关系良好。

3.5.2 方法的检出限以及定量限

以3倍信噪比(S/N=3)作为方法的检出限，以10倍信噪比(S/N=10)作为方法的定量限。结果表明，12种化合物的检出限(limit of detection，LOD)在1.1～16.8 μg/kg之间；12种化合物的定量限(limit of quantification，LOQ)在3.6～55.4 μg/kg之间(见表3)，能够充分满足日常的检测需求。

表3 方法的检出限和定量限

3.5.3 方法的回收率以及精密度

分别选取6种不同基质的空白样品(菜籽油、辣椒油、芝麻油、花生油、花椒油、橄榄油)添加3个浓度水平的标准溶液，每个浓度水平6次，按照方法规定的步骤进行测定，加标回收率范围在72.3%～110.4%之间，RSD(n=6)为2.1%～6.9%，结果见表4。

表4 12种化合物的回收率和精密度

续表4

3.5.4 实际样品分析

随机抽取监督抽查的30批次6种基质(菜籽油、辣椒油、芝麻油、花生油、花椒油、橄榄油)样品，用本方法进行测定。结果显示，其中乙基麦芽酚被检出的样品有4个，其含量范围为19.2～5013 μg/kg，香兰素被检出的样品有9个，其含量范围为89.3～351 μg/kg，7-甲氧基香豆素被检出的样品有5个，其含量范围为170～692 μg/kg，二氢香豆素被检出的样品多达10个，其含量范围为1125～2698 μg/kg，其中以辣椒油、芝麻油、花椒油三种主要调味油的检出率为最高，此现象应引起有关市场监督部门的重视。

4 结 论

本课题通过对样品提取方式和前处理的优化和超高效液相色谱-串联质谱分析仪器方法的优化，建立了一种能够同时检测食用油中乙基麦芽酚、香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香豆素、7-甲氧基香豆素、二氢香豆素、7-甲基香豆素、7-乙氧基-4-甲基香豆素、醋硝香豆素、环香豆素和7-二乙胺香豆素12种增香剂的分析方法。该方法前处理简单，不需要复杂的操作，还能够应用于样品量大的情况；在某些检测物含量浓度较低的水平下也能有呈现很好的线性关系和回收率，并且灵敏度和选择性都很优，检出限和定量限都可以满足日常食用油的检测需求，能为我国食用油产品中的安全指标检测提供有力的技术支持。