超分子萃取技术测定滴眼液中的4种防腐剂*

粟 雯，陈志良，刘梯楼

(1 邵阳学院药学院，湖南 邵阳 422000；2 湘西南中药开发利用湖南省工程研究中心，湖南 邵阳 422000)

对羟基苯甲酸酯又名尼泊金酯，因其抗菌性强，无臭无味，毒性低，刺激性小，被广泛应用于液体制剂中。目前使用较多的是对羟基苯甲酸甲酯(methylparaben，MP)、对羟基苯甲酸乙酯(ethylparaben，EP)、对羟基苯甲酸丙酯(propylparaben，PP)和对羟基苯甲酸丁酯(butylparaben，BP)[1-2]。而滴眼液是眼科常用的液体治疗制剂，通常需要加入微量的防腐剂，以提高药物的稳定性，并防止病原微生物的污染。但是滴眼液的不当使用可能会损伤眼表, 进而引发视功能的障碍, 而滴眼液中防腐剂的过量添加就是导致这些损害的重要原因[3-4]。

由于滴眼液中防腐剂含量较低，目前，前处理方法主要包括固相萃取[5-6]，液液萃取[7]，超声萃取[8-9]等，但是这些方法一般所需溶剂用量高，分析时间长，萃取效率较低，此外大量有机溶剂的使用也会对实验环境和相关人员产生不利的影响。因此，发展简单环保，绿色高效的前处理技术是很有必要的。超分子溶剂(supramolecular solvent，SUPRAS) 萃取技术一般是由两种或两种以上两亲性分子依靠非共价作用结合在一起，有组织的自发形成具有纳米结构的胶束聚集体。其由西班牙学者 Rubio等[10-11]提出，通常由长链烷基醇或烷基酸与四氢呋喃(THF)和水混合，形成比水密度轻的反相胶束。由于其具有高浓度的两亲化合物，并且简单环保，萃取高效，被广泛应用于萃取不同极性的化合物[12]。

本研究以THF为分散剂，壬醇为萃取剂，在水中自发组装形成超分子溶剂，对滴眼液进行液液微萃取，结合高效液相色谱法，建立了滴眼液中4种对羟基苯甲酸酯类物质(MP、EP、PP、BP)的分析方法。本方法简单环保，快速高效，回收率高，可适用于羟苯酯类物质的同时分析测定。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

E2695高效液相色谱仪，美国Waters公司；H-1850台式高速离心机，湖南湘仪；QL-901涡旋混合器，海门其林贝仪尔仪器制造有限公司；BSA124S电子分析天平，德国赛多利斯。

甲醇，德国默克公司；四氢呋喃，Adamas；对羟基苯甲酸酯类标准品(对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯，对羟基苯甲酸丙酯，对羟基苯甲酸丁酯，Dr.E)；壬醇，Adamas；小乐敦复方牛磺酸滴眼液，曼秀雷敦中国药业有限公司：批号21K291；乐敦清复方氯化钠滴眼液，曼秀雷敦中国药业有限公司：批号21E051；珍视明四味珍层冰硼滴眼液，江西珍视明药业有限公司：批号210209；屈臣氏蒸馏水。

1.2 标准溶液的配制

购买的为溶于甲醇的1000 μg/mL的对羟基苯甲酸酯类标准储备溶液，分别取4种物质标准储备溶液，将其混合均匀成100 μg/mL的混合物质标准储备液，置于4 ℃冰箱内保存待用，使用时，用甲醇逐级稀释成一系列标准浓度的质量溶液，现用现配。

1.3 超分子溶剂的制备

取1 mL THF和300 μL壬醇迅速注入10 mL的离心管中，加入4.7 mL蒸馏水(保持溶剂总体积为6 mL)，涡旋30 s,混合均匀后以3000 r/min的速度离心5 min，用微量注射器移取上层有机相至玻璃瓶中，即得超分子溶剂，于4 ℃冰箱中密封保存。

1.4 样品处理

移取滴眼液5 mL于离心管中，加入2 mL的超分子溶剂，涡旋振荡3 min后，以3000 r/min的速度离心5 min，移取上层液体，用微孔滤膜(0.22 μm)过滤后，待高效液相色谱测定。

1.5 色谱条件

色谱柱为Servo-PT C18120A(250 mm×4.6 mm×5 μm)；柱温25 ℃；进样量10 μL；流动相为甲醇(A): 水溶液(B)；梯度洗脱程序：0～2.0 min，5%～20% A；2.0～4.0 min，20%～50% A；4.0～7.0 min，50%～80% A；7.0～9.0 min，80% A；9.0～10.0 min，80%～5% A；流速为1.0 mL/min；检测波长为254 nm。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

分别对甲醇-水，乙腈-水，甲醇-0.1%甲酸水，乙腈-0.1%甲酸水四种流动相进行考察，结果表明，以甲醇-水为流动相时，4种目标物的分离度较好，没有重合，且毒性相对较小，总的分析时间短，保留时间合适，在10 min内可全部出峰。同时结果显示，在波长为254 nm处，四种目标物都有较高的灵敏度，因此最终确定检测波长为254 nm。

2.2 超分子溶剂萃取条件的选择

2.2.1 超分子溶剂的筛选

基于长链烷基醇与有机溶剂(例如THF)和水自主装形成的超分子溶剂，烷基醇的碳原子数种类不同，会导致反向胶束的孔径不同，从而影响超分子溶剂的尺寸及萃取能力。本实验固定THF的含量为1 mL，选择不同碳数的长链烷基醇(C8～C12)与THF组成对应的超分子溶剂，在相同条件下对苯甲酸酯类物质进行萃取。在萃取过程中，壬醇/THF/水超分子溶剂体系对四种对羟基苯甲酸酯类物质萃取率较高，且溶解性好操作方便，最终实验采用壬醇作为萃取溶剂，与THF和水组成超分子溶剂体系。

2.2.2 壬醇用量的优化

本研究考察了壬醇用量分别为250、300、350、400和450 μL时目标物质的萃取率，如图2所示。如图所示，随着壬醇用量的增加，各目标物的萃取率先升高后降低，在壬醇的用量为300 μL时，四种目标物都有较高的萃取率，因此在后续实验中，壬醇的用量设置为300 μL。

2.2.3 THF用量的优化

THF作为超分子溶剂的重要组成部分，其含量大小是影响萃取率的重要因素。如THF含量过低，那长链烷醇会析出沉淀，无法形成超分子溶剂，如THF过高，其会分散在水溶液中，无法实现超分子溶剂体系的有效分层。本实验考察了THF的用量分别为0.5、0.75、1、1.25、1.5 mL时目标物质的萃取率，如图所示。随着THF用量逐渐增大，四种目标物的萃取率先升高后下降，当THF的用量位于为1 mL时，四种目标物的回收率位于86.2%～94.3%之间，且结果较为稳定，因此在后续的实验中，THF的用量设置为1 mL。

2.2.4 超分子溶剂用量的优化

本研究考察了不同超分子溶剂体积(0.5、1、1.5、2和 2.5 mL)对萃取效率的影响，随着超分子溶剂体积的增加，对目标物的萃取效率逐渐加强。当超分子体积达到2 mL时，4种对羟基苯甲酸酯类物质都具有较高的萃取率，继续加入超分子溶剂，萃取率基本维持稳定，无较大变化。因此超分子溶剂最佳用量设置为2 mL。

图1 (a)壬醇的用量、(b)THF的用量、(c)超分子溶剂体积对萃取率的影响

2.3 方法的评价

2.3.1 对羟基苯甲酸酯类物质的色谱图

依据1.5的色谱条件，4种对羟基苯甲酸酯类混合物标准溶液的色谱图如图2所示。

图2 四种对羟基苯甲酸酯类化合物标准溶液的高效液相色谱图

2.3.2 线性范围、相关系数、检出限和定量限

依据对应的实验方法，分析一系列混合物标准梯度溶液，用各标准物的质量浓度(mg/L)和对应的峰面积制作标准曲线，计算线性回归方程及相关系数。并分别根据信噪比(S/N=3)和信噪比(S/N=10)计算方法检出限和定量限，结果见表1所示。结果表明，4种对羟基苯甲酸酯类物质在0.1～50 mg/L的范围内线性关系良好，相关系数均不小于0.9991，检出限在4.8～5.9 μg/L，定量限在16.1～19.7 μg/L。

表1 对羟基苯甲酸酯类的线性范围、线性方程、

2.3.3 回收率与精密度

表2 四种对羟基苯甲酸酯类物质的回收率和相对标准偏差

在最优的萃取实验条件下，在待测样品中分别添加低(20 μg/L)、中(50 μg/L)、高(100 μg/L)三个水平的混合标准溶液，进行加标回收率实验，平行测定五组，如表2所示，样品的平均回收率在92.8%～105.6%之间，RSD在1.3%～4.7%之间。

2.4 实际样品的测定

为了验证该方法的实际应用，我们随机对市场上销售的三种滴眼液中的对羟基苯甲酸酯类物质进行了含量测定。检测结果表明，在这三种滴眼液中都未检测到对羟基苯甲酸酯类物质。

3 结 论

本文建立了以壬醇-THF-水为超分子溶剂提取测定滴眼液中对羟基苯甲酸酯类物质的新方法。分别对液相色谱条件，长链烷基醇的选择与用量、THF用量、萃取所用超分子溶剂进行了优化考察,并且通过HPLC实现了同步测定4类对羟基苯甲酸酯类物质。此种方法萃取步骤简单，绿色环保，消耗体积少且回收率高,适用于滴眼液中羟苯酯类物质的测定。