雪莲黄酮胶囊对高原缺氧诱导小鼠心肌损伤的保护作用研究

张朋朋，李 琳，石志群，何 蕾，马慧萍

（1. 中国人民解放军联勤保障部队第九四O医院药剂科全军高原医学实验室，甘肃 兰州 730050；2. 甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000）

环境条件是维持机体正常生理功能的重要因素，长期生活于低海拔地区的人，当快速进入海拔3 000 m 以上高原时，通常会出现头痛、全身乏力等急性高原反应[1]。高原低压性缺氧能够诱导活性氧自由基（ROS）的快速积累，导致机体氧化应激水平升高，从而造成机体损伤。心脏是机体最重要的器官之一，对高原急性低压缺氧条件十分敏感[2]。当机体长期处于缺氧状态下，心率、血压发生改变，心脏负荷增加，心脏能量供应不足，最终导致机体损伤。高原低压性缺氧严重地限制了初到高海拔地区人们的生活和工作，甚至危及生命。

雪莲是我国高山地区常用的名贵中草药，近年来，国内对雪莲药理作用的研究主要集中于提高机体免疫力、抗氧化及抗辐射等作用[3]，而关于抗高原缺氧作用的研究较少。本课题组前期对20 多种青藏高原植物进行筛选，发现大苞雪莲具有显著的抗缺氧活性，并通过最佳提取工艺研究[4]、质量标准研究[5]，研制出用于高原缺氧防治的医院制剂——雪莲黄酮胶囊。在本课题组前期研究中确定了最佳给药剂量为500 mg/kg[6]。本实验使用低压低氧动物实验舱模拟海拔8 000 m 高原缺氧环境，通过检测急性高原缺氧小鼠心脏的组织学、缺氧相关生化指标和基因蛋白的变化情况，研究雪莲黄酮胶囊对于缺氧小鼠心脏的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性Balb/c 小鼠64 只，体重18～22 g，购自空军军医大学实验动物中心，许可证号：SCXK（陕）2019-001，伦理审批编号：2021KYLL170。饲养于联勤保障部队第九四〇医院动物实验科。

1.2 药物与试剂

乙酰唑胺（武汉远城科技发展有限公司, 59-66-5）；雪莲黄酮胶囊（中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院制剂）； 乳酸（LD）、乳酸脱氢酶（LDH）、总抗氧化能力（T-AOC）、BCA 蛋白试剂盒（南京建成生物工程研究所，A003-1-2）；RNAiso试剂、TakaRa Prime ScriptTM 试剂盒、PCR 扩增试剂盒（大连宝生物公司，引物委托宝生物工程公司合成）；缺氧诱导因子1α（HIF-1α）抗体、血管内皮生长因子（VEGF）抗体、超氧化物歧化酶（SOD）抗体（Abcom，英国）；抗体(BD，美国)；Western BrightTM ECL（Advansta，美国）。

1.3 仪器

Delta 320 电子pH 计（梅特勒托利多公司）；IEC-Micromax 高速离心机（美国ThermoElectron公司）；Tissuelyser 快速研磨仪（上海净信科技公司）；BP210S 电子天平（赛多利斯有限公司）；HP-8453 紫外分光光度计（美国惠普公司）；SpectraMax i3 全自动荧光酶标仪（美国Molecular Devices 公司）；FLYDWC20-ⅡA 大型低压低氧动物实验舱（中航贵州风雷航空军械有限责任公司）。

1.4 动物分组及处理

取SPF 级健康雄性Balb/c 小鼠64 只，饲养适应3 d 后随机分为正常组（N）、模型组（M）、乙酰唑胺阳性对照组（ACZ，250 mg/kg）、雪莲黄酮胶囊组（XLJN，500 mg/kg）4 组，每组16 只，单次灌胃给药，除正常组小鼠外，其余各组小鼠给药50 min 后放入低压低氧动物实验舱，模拟8 000 m 海拔缺氧环境。以10 m/s 的速度升至8 000 m 海拔，维持缺氧9 h，完成减压缺氧后以20 m/s 的速度降至海拔1 450 m。小鼠完成减压后立即脱臼处死，取心肌组织，-80 ℃冰箱冻存备用。

实验过程严格按照“3R”原则进行，实验废弃物及动物尸体等按照《医疗废物管理条例》要求进行无害化处理，严格遵守国家科技部《关于善待实验动物的指导性意见》，尽可能减少对动物的伤害。

1.5 组织学观察

1.5.1 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠心脏显微结构的影响

每组随机取3 只小鼠心脏组织标本，置于甲醛中固定。标本送至联勤保障部队第九四〇医院病理科进行石蜡包埋、组织切片、染色以及观察。

1.5.2 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠心脏超显微结构的影响

每组随机取3 只小鼠心脏标本，切成1 mm×1 mm×3 mm 的小块，置于2.5%戊二醛中固定，之后对标本进行浸透包埋以及电镜观察。

1.6 生化指标测定

取各组剩余10 只小鼠的心肌组织50 mg，加入9 倍质量的0 ℃生理盐水，匀浆并离心，取上清，-20 ℃冷冻，用于LD、LDH、T-AOC 指标测定。以上操作均按试剂盒说明书要求进行。

1.7 RT-PCR 测定mRNA 表达水平

取各组剩余10 只小鼠心肌组织标本30 mg，向低压低氧处理的小鼠心肌组织中加入1 ml RNAiso Plus 试剂进行研磨，加入200 μl 氯仿，混匀后离心，弃上清液，取75%乙醇溶液纯化总RNA沉淀，再次离心弃上清液，将所得RNA 于-80 ℃保存。紫外分光光度计检测总RNA 的浓度及纯度，并使用1 %甲醛变性琼脂糖电泳检测其完整性。将提取的总RNA 进行逆转录，具体步骤参考PrimeScriptTM RT 试剂盒说明书。实时PCR 检测：步骤参考Applied Biosystems公司7300 仪器说明。反应条件如下：两步法PCR 扩增，95 ℃预变性30 s；95 ℃反应5 s，60 ℃退火31 s，40 个循环。引物及序列见表1。

1.8 蛋白质印迹法测定HIF-1α、VEGF、SOD 蛋白的表达

取各组剩余10 只小鼠心肌组织标本50 mg，加入高效裂解液，匀浆，于冰上裂解30 min，低温离心后吸取部分上清液，用于BCA 法对总蛋白浓度进行定量。向剩余上清液中加入3 倍量上样缓冲液，95 ℃加热10 min，取等量蛋白样品上样，采用SDS-PAGE 进行分离，电泳完成后将蛋白转至PVDF 膜，将PVDF 膜浸泡于5%脱脂牛奶室温封闭2 h，分别加入小鼠抗β-actin 单抗抗体（1∶1 000）、HIF-1α 兔多克隆抗体（1∶500）、VEGF 兔多克隆抗体（1∶1 000）、SOD 兔多克隆抗体（1∶1 500），4 ℃孵育过夜，TBST 缓冲液漂洗。加入二抗，室温孵育2 h，TBST 缓冲液漂洗。配制ECL 发光液，按照A 液和B 液1∶1 进行配制，加入发光液，使用ChemiDoc MP Imaging System 全能型成像系统进行曝光。使用ImageJ 软件对蛋白条带进行灰度值分析。

表1 Real Time RT- PCR 引物序列

1.9 统计学处理

图1 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠心肌组织显微结构的影响(200×)

2 实验结果

2.1 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠心肌组织显微结构的影响

结果如图1 所示，N 组心肌组织结构正常，细胞形态结构完好；M 组心肌细胞肿胀，心肌纤维增粗，排列不整齐，胞核增大淡染；ACZ 组与XLJN 组的肌纤维肿胀、排列不齐现象，其程度有所减轻；心肌收缩舒张功能损伤减轻。

2.2 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠心肌组织超显微结构的影响

如图2 所示，N 组心肌组织肌纤维排列整齐且紧密。肌节分明，肌线清晰，线粒体形状规则，膜光滑，内嵴清晰可见。M 组肌丝溶解、破裂，肌丝排列疏松，基膜下肿胀、变形。线粒体肿胀，产生空泡，双层膜结构溶解。ACZ 组肌丝排列疏松，线粒体基本正常，肌丝连接处部分溶解，连接不整齐。XLJN 组，肌纤维与线粒体形态良好，远优于模型组。综上所述，雪莲黄酮胶囊对心肌的超显微结构具有明显的保护作用。

2.3 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠心肌组织生化指标的影响

如表2 所示，缺氧后，M 组LD 含量升高（P＜0.01），T-AOC 活性显著降低（P＜0.01），LDH 活性无显著变化（P＞0.05）。与M 组相比，ACZ 组与XLJN 组的小鼠心肌组织LD 活性降低（P＜0.01），LDH 活性无明显变化（P＞0.05），T-AOC 活性升高（P＜0.01）。

2.4 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠心肌组织缺氧相关mRNA 的影响

如表3 所示，与N 组相比，M 组小鼠心肌组织HIF-1α 和VEGF 的mRNA 水平显著提高，SOD、过氧化氢酶（CAT）mRNA 水平显著降低（P＜0.01）；与M 组相比，ACZ 组、XLJN 组心肌组织HIF-1α、VEGF 的mRNA 表达水平均有所下降（P＜0.05），SOD、CAT 的mRNA 表达水平显著提高（P＜0.01）。

2.5 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠心肌组织缺氧相关蛋白含量的影响

图2 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠心肌组织显微结构的影响

表2 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠心肌组织生化指标的影响(±s，n=10)

表2 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠心肌组织生化指标的影响(±s，n=10)

*P＜0.05，**P＜0.01，与M组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与N组比较。

组别 例数（n） 剂量（mg/kg） LD含量（mmol/g蛋白） LDH活性（U/g蛋白） T-AOC活性（U/mg蛋白）N组 10 — 0.405±0.050 1 919.8±143.1 1.58±0.23 M组 10 — 0.579±0.032## 1 871.0±95.9 1.11±0.10##ACZ组 10 300 0.513±0.059* 1 925.9±141.4 1.30±0.21**XLJN组 10 500 0.524±0.057** 1 916.8±129.1 1.34±0.19**

表3 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠心肌组织HIF-1α、VEGF、mRNA 的影响(±s ，n=10)

表3 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠心肌组织HIF-1α、VEGF、mRNA 的影响(±s ，n=10)

*P＜0.05，**P＜0.01，与M组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与N组比较。

组别 例数（n） 剂量 （mg/kg） HIF-1α mRNA VEGF mRNA SOD mRNA CAT mRNA N组 10 — 0.88±0.10 0.99±0.46 1.42±0.41 1.70±0.19 M组 10 — 6.21±0.79## 9.77±1.44## 0.41±0.16# 0.15±0.07#ACZ组 10 300 1.15±0.27** 2.72±0.54* 1.37±0.19** 0.63±0.16**XLJN组 10 500 1.34±0.36* 2.73±0.99* 1.28±0.38** 0.44±0.05**#

如图3、图4 所示，与N 组相比，M 组小鼠心肌组织HIF-1α、VEGF 蛋白表达显著升高（P＜0.01），SOD 蛋白表达显著降低（P＜0.01）。与M 组相比，XLJN 组和ACZ 小鼠心肌组织HIF-1α、VEGF 蛋白表达显著降低（P＜0.01），SOD 蛋白表达显著升高（P＜0.01）。

图3 雪莲黄酮胶囊对缺氧小鼠心肌缺氧相关蛋白表达电泳图

图4 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠心肌缺氧相关蛋白表达量的比较

3 讨论

低压低氧条件能够诱导ROS 的快速积累，导致机体氧化应激水平升高，心脏中的氧气浓度低于临界值，造成能量衰竭，同时伴随组织ATP 水平下降，引发细胞内离子稳态失衡及不可逆的膜结构损伤[7]。部分研究表明，抗氧化剂具有一定的抗缺氧作用，例如，葛根素、去甲汉黄芩素、槟榔多酚等抗氧化剂能够通过清除ROS 缓解缺氧损伤[8-11]。本课题组前期研究发现，雪莲中黄酮成分具有优异的抗氧化作用[12]，为此，我们对雪莲黄酮胶囊的高原缺氧诱导小鼠心肌损伤的保护作用进行考察。结果发现，与M 组相比，XLJN 组小鼠肌纤维形态明显改善，线粒体膜完好，说明雪莲黄酮胶囊对于模拟高原缺氧小鼠心肌的形态结构具有较好的保护作用。

在缺氧环境下，组织呼吸链受抑制，ATP 酶活性下降，有氧呼吸产生ATP 的量减少。为弥补能量缺失，糖酵解作用加强，并成为组织供能的主要途径[13]。LDH 可催化丙酮酸与LD 间的相互转化，低氧条件下LDH 促进厌氧糖酵解，产生的LD 反过来又会提高其活性[14]，这就解释了本研究中M 组的LDH 没有升高的现象。有研究发现，组织中LD 含量的增加直接反映机体的缺氧程度。根据本文研究结果，雪莲黄酮胶囊可显著降低缺氧心肌的LD 水平、提高T-AOC 活性，由此推断，雪莲黄酮胶囊能够提高乳酸的代谢转化，促进细胞无氧酵解。

缺氧诱导因子-l（HIF-1）是近年来发现对缺氧环境高度特异性的转录因子，是专一调节氧稳态的关键介质[15]。HIF-1 可能作为活性氧受体，感受环境中的低氧程度，同时调控具有效应器作用的低氧反应基因的转录[16]。表皮生长因子（VEGF）作为HIF-1 的下游基因，可调节毛细血管通透性和血管生成。本实验通过RT-PCR 检测缺氧相关基因，发现缺氧可造成心肌组织HIF-1、VEGF 的mRNA 表达明显升高，而雪莲黄酮胶囊可使HIF-1α、VEGF的mRNA 表达降低，由此推断，雪莲黄酮胶囊通过降低小鼠心脏对于缺氧的敏感性，延缓组织水肿来抵抗缺氧造成的损伤，该结论与Xu 等[17]研究一致。SOD 与CAT 是机体清除自由基的主要酶，是抗缺氧能力的重要指标。缺氧可造成模型组SOD、CATmRNA 表达与蛋白含量降低，雪莲黄酮胶囊给药后，缺氧小鼠的SOD、CAT 的mRNA 表达、蛋白含量显著提高，证明其能够通过增加缺氧小鼠心肌SOD 与CAT 的含量，提高心肌的抗氧化能力。

综上所述，雪莲黄酮胶囊能显著减轻高原缺氧对小鼠心肌组织显微结构和超显微结构的损伤，说明雪莲黄酮胶囊对低压性缺氧造成的组织损伤具有良好的保护作用。此外，雪莲黄酮胶囊还可显著降低缺氧小鼠心肌组织LD 累积水平，因此改善心肌组织能量代谢，这也可能是其发挥保护功能的原因之一。进一步的分子实验结果表明，雪莲黄酮胶囊抗高原缺氧的机制可能与影响HIF-1α、VEGFmRNA与蛋白的表达、调节小鼠组织内部氧平衡、血管通透性、提高SOD、CAT 等抗氧化酶含量有关。下一步，我们将对雪莲黄酮胶囊的药动学进行研究，为将其开发成为抗缺氧药物提供了一定的理论和实验依据。