UGT1A6基因多态性对神经外科颅脑疾病患者丙戊酸钠血药浓度的影响

段坤坤，朵德龙，赵 妮，陈 倩，王 洁，崔雯丽，桓芝兰，王亚峰*

1.青海大学医学院(青海 西宁 810001) 2.青海省人民医院药学部(青海 西宁 810007)

颅脑疾病包括脑出血、创伤性颅脑损伤、颅内占位性病变等，可通过引起神经递质失衡、离子通道异常、线粒体功能障碍等多种机制诱导继发性癫痫的发作。丙戊酸钠(VPA)是临床常用的一线广谱抗癫痫药物，对颅脑疾病患者继发性癫痫的发作具有良好的预防效果，但VPA的治疗窗较窄且患者的个体化差异较大，血药浓度偏离50～100 μg/mL的参考范围时，可能导致临床疗效不佳或药物不良反应发生的风险增大。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)代谢了人体约50%的VPA，其主要亚型UGT1A6的基因多态性位点T19G可能通过改变酶蛋白的结构，影响其表达和活性，是增大患者个体间VPA药动学差异的重要因素[1]，本研究探讨其对颅脑疾病患者VPA血药浓度的影响，以期为临床合理用药提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料收集2021年9月-2021年10月青海省人民医院神经外科收治的颅脑疾病患者，Excel记录患者的一般资料，包括患者性别、年龄、身高、体质量、给药剂量、血药浓度、肝肾功能和临床诊断等，本研究通过了青海省人民医院伦理委员会批准(审批号：2021-91)及中国人类遗传资源采集审批(审批号：2021-CJ2667)。纳入标准：①神经外科颅脑疾病患者，包括脑挫伤、硬膜下出血、硬膜外出血、基底节区出血、蛛网膜下腔出血等；②使用VPA并进行了血药浓度监测；③VPA血药浓度达稳态(至少5个半衰期)；④肝肾功能正常且无其他脏器严重疾病；⑤否认家族遗传病史。排除标准：①孕妇或平时持续服用抗癫痫药物治疗的癫痫患者；②发生药物不良反应；③入院后使用可能影响VPA血药浓度的药物，如碳青霉烯类抗生素、苯妥英钠、卡马西平等；④未签署患者知情同意书。本研究共纳入颅脑疾病患者38例，男性29例，女性9例；年龄18～72岁，平均(48.47±14.74)岁；体质量指数(BMI)16.00～29.73 kg/m2，平均BMI(23.19±3.18)kg/m2；单位体质量给药剂量6.35～22.22 mg/kg，平均单位体质量给药剂量(12.22±2.73)mg/kg；VPA血药浓度18.24～99.47 μg/mL，平均VPA血药浓度(53.79±19.73)μg/mL；VPA标准化血药浓度1.60～7.81(μg·kg)/(mL·mg)，平均VPA标准化血药浓度(4.43±1.50)(μg·kg)/(mL·mg)。

1.2仪器与试剂ADVIA Centaur CP化学发光免疫分析仪(西门子医学诊断股份有限公司)，H2-16KR医用离心机(湖南可成仪器设备有限公司)，9700 PCR扩增仪(美国Applied Biosystems公司)，3730XL基因测序仪(美国Applied Biosystems公司)，NanoDrop2000超微量分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司)，血凝块基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，VPA试剂盒(西门子医学诊断股份有限公司)，VPA校准品(西门子医学诊断股份有限公司)，免疫分析质控物370(伯乐实验有限公司)，VPA注射液(四川科瑞德制药股份有限公司)。

1.3血药浓度的测定及标准化患者的VPA血药浓度达稳态后，在次日清晨给药前，空腹条件下用含有惰性分离胶的促凝管取静脉血2～3 mL，3 500 r/min离心10 min，取上层血清，按照化学发光免疫分析仪的操作流程测定VPA血药浓度。VPA标准化血药浓度=VPA血药浓度(μg/mL)/单位体质量给药剂量(mg/kg)。以消除给药剂量、患者体质量对VPA血药浓度的影响，探究单位体质量内每毫克药物所引起的血药浓度变化。

1.4 DNA的提取VPA血药浓度测定结束后，弃去上层血清，取约1 mL的血凝块，根据血凝块基因组DNA提取试剂盒操作步骤提取DNA。NanoDrop 2000超微量分光光度计测定提取DNA的浓度和纯度，OD260/OD280比值在1.7～1.9范围内视为纯度达到实验要求，DNA样本于-25℃环境下保存。

1.5基因测序及分型NCBI数据库中输入UGT1A6 T19G位点名称，引物设计软件Primer Premier 5.0设计筛选各基因特异性引物见表1，引物的合成、聚合酶链式反应-限制性长度片段多态性(PCR-RFLP)技术进行基因测序等由北京六合华大基因生物科技有限公司完成。PCR扩增反应体系为：PCR Mix 22 μL，Primer F (10 pmol/μL)1 μL，Primer R (10 pmol/μL)1 μL，DNA 1 μL。PCR的扩增反应程序为：96℃预变性5 min，96℃变性20 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，共10个循环，每个循环退火温度降低1℃。96℃变性20 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环。取3 μL PCR产物进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳实验并于254 nm紫外灯下拍照记录电泳图谱，磁珠对PCR产物进行纯化后通过基因测序仪测序，测序结束后对测序峰图进行命名、分类，phred/phrap软件进行多态性分析并导出分析结果。

表1 UGT1A6 T19G的PCR引物序列

2 结果

2.1基因分型结果UGT1A6 T19G 基因片段PCR扩增引物的琼脂糖凝胶电泳图(图1)，M泳道为Marker，从上到下依次为5 000、3 000、2 000、1 000、750、500、250、100 bp，1～4泳道为T19 G(rs6759892)的PCR扩增引物，UGT1A6 T19G不同基因型的测序峰图见图2。UGT1A6 T19G的基因型分布频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡(P>0.05)，纳入的样本具有较好的群体代表性。其中，野生型(TT)14例，突变杂合型(TG)22例，突变纯合型(GG)2例，等位基因突变率为34.21%，见表2。

图1 UGT1A6 T19G基因片段PCR扩增引物的琼脂糖凝胶电泳图

注：(a)：T19G TT基因型；(b)：T19G TG基因型； (c)：T19G GG基因型。

表2 UGT1A6 T19G的基因型频率分布[n(%)]

2.2不同基因型患者的一般资料比较UGT1A6 T19G不同基因型患者的性别、年龄、BMI比较，差异无统计学意义(P>0.05)，UGT1A6 T19G TT基因型患者的单位体质量给药剂量低于TG基因型患者(P<0.05)，见表3。

表3 UGT1A6 T19G不同基因型患者的一般资料比较

2.3基因多态性对VPA血药浓度的影响UGT1A6 T19G不同基因型患者VPA血药浓度比较，差异无统计学意义(P>0.05)。TT基因型患者VPA标准化血药浓度显著高于TG、GG基因型患者(P<0.05)，见表4。

表4 UGT1A6 T19G不同基因型患者的VPA血药浓度

3 讨论

UGT属于微粒体糖基转移酶家族，可将尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的葡萄糖醛酸基团转移到其他化合物上，增加其极性，促使其通过尿液排出体外，广泛参与了胆红素、脂肪酸等内源性化合物及药物等外源性化合物的代谢。UGT1A6在VPA代谢过程中发挥着重要作用，其多态性位点T19G在我国人群中具有较高的等位基因频率。本研究发现，UGT1A6 T19G等位基因突变率为34.21%，与Banawalikar等[2]报道的31.50%相近，但该研究以印度癫痫患儿为研究对象，得出的结论可能并不具有普遍性。林雪玉等[3]研究纳入了107例汉族癫痫患者，发现UGT1A6 T19G等位基因突变率为16.8%，韩海燕等[4]研究以神经外科颅脑手术患者为研究对象，发现该位点的等位基因突变率为24.54%，均低于本研究的34.21%。不同研究得出的UGT1A6 T19G等位基因突变率存在较大差异，可能与纳入的患者类型及样本量大小有关，或等位基因的分布存在显著的种族差异和地区差异。

本课题组在前期研究中发现[5]，颅脑疾病患者VPA血药浓度的影响因素主要有患者的性别、BMI、单位体质量给药剂量，在本研究中需排除这些因素对研究结果的干扰。患者一般资料的分析结果表明，UGT1A6 T19G不同基因型患者的性别分布、年龄、BMI均无显著性差异，但TG基因型患者的单位体质量给药剂量显著高于TT基因型的患者，本研究采用了患者的VPA标准化血药浓度，可在一定程度上减少患者体质量、给药剂量对研究结果的干扰。结果表明，UGT1A6 T19G不同基因型患者的VPA血药浓度无显著差异，而不同基因型患者的VPA标准化血药浓度有显著性差异，其中，TT患者虽具有较低的单位体质量给药剂量，但其VPA标准化血药浓度显著高于TG和GG患者。韩海燕等[4]研究纳入了55例神经外科预防性用药VPA的患者，发现TT患者的VPA血药浓度显著高于突变基因携带者(TG、GG)，与本研究结论一致。说明突变基因可能增加了UGT1A6的活性，使VPA代谢加快，标准化血药浓度降低，临床用药过程中应酌情增加其给药剂量，而TT患者可能需要更低的给药剂量。有研究得出了不同的结论，Nandith等[6]研究发现，UGT1A6 T19G位点不同基因型患者的VPA标准化血药浓度无显著性差异(P>0.05)，Xu等[7]的研究也得出了同样的结论，但这两项研究均以癫痫患儿为研究对象，儿童患者和成人患者的VPA代谢模式差异可能导致研究结果的不同，得出的结论也未必适用于颅脑疾病患者。基于目前的研究结果，颅脑疾病患者的VPA血药浓度是由多个基因共同调控的结果，单个位点的基因多态性对VPA血药浓度的影响可能有限，未来的研究中，可进一步探究基因组的基因多态性对VPA血药浓度的影响，为颅脑疾病患者的个体化用药提供理论依据。