帕金森病患者肠道微生物及短链脂肪酸差异分析

王 屹，陈新平，陈 亮，刘志忠

0 引 言

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是常见的慢性神经退行性疾病之一，出现典型的运动功能缺失前，表现为非运动系统症状，如异常的胃肠运动和便秘[1-2]。PD进展中，运动波动和非运动症状严重程度与小肠细菌过度生长具有相关性。治疗小肠细菌过度生长可以改善PD患者的运动波动症状[3]。这些证据表明肠道微生物-肠-脑轴的相互作用可能参与了PD病理过程，提示 PD的病理过程可能是由肠道扩展到脑[4-5]。

PD早期胃肠功能紊乱或肠内渗透压增加，免疫系统过度刺激，可能引起系统性炎症，激活肠神经元和肠胶质细胞，从而引起PD病理关键蛋白突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)错误折叠。某些肠道微生物的缺失可能伴随着短链脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)显著减少，结肠上皮细胞受损，同时影响宿主的生理状态，从而可能导致内毒素和神经毒素产生增加[6-7]。移植健康对照肠道微生物或喂食丁酸盐能改善PD动物模型的运动损伤和多巴胺缺失[8-9]。2016年Sampson等[10]研究结果表明，α-syn的转基因小鼠在常规菌群环境中很快出现神经炎症，并出现α-syn的病理变化和运动障碍，处于无菌环境或给与抗生素则会抑制这种变化，但这种现象会被移植PD患者肠道菌群或口服肠道代谢产物SCFAs而反转。Unger等[11]研究表明PD组和对照之间的粪便SCFAs比率发生变化，可能意味着SCFAs的变化在PD中发挥重要作用。

尽管肠道微生物和SCFAs在PD病理过程发挥作用的相关研究很多，然而至今没有定论。本研究旨在明确PD患者肠道微生物和SCFAs的变化情况，为进一步深入研究PD的病理机制提供依据。

1 资料与方法

1.1 粪便样本收集2018年1月至2019年12月北京市海淀医院神经内科门诊就诊的PD患者(PD组，n=20)和体检中心健康人群(对照组，n=13)粪便样本。纳入标准：留取样本前3个月中，未使用过抗生素药物、益生菌或益生菌产品，所有受试者均无胃肠道病史。排除标准：有特殊的饮食习惯或饮食限制(如由于食物不耐受)，近3个月出现胃肠道功能紊乱。PD患者的Hoehn and Yahr(H-Y)中H-Y 1级2例、2级5例、3级13例。PD组和对照组年龄和性别分布差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。粪便样本收集均按照样本收集规范进行，收集在无菌干燥容器内，并避免污染，样本保存在-80℃冰箱尽快检测。本研究经过北京博爱医院伦理委员会的批准(批准号：2017-068-1)，患者均签署知情同意书。

表1 入组患者PD组和对照组一般情况比较

1.2粪便样本肠道微生物分析通过QIAamp DNA Stool Mini kit(Qiagen)提取试剂盒提取微生物基因DNA，利用 1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组 DNA。按指定测序区域，合成带有 barcode 的特异引物。使用TransStartFastpfu DNA Polymerase(TransGen AP221-02)，在ABI GeneAmp© 9700 型PCR 仪(美国ABI公司)上进行PCR；每个样本 3 个重复，将同一样本PCR 产物混合后用 2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用xyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN 公司)切胶回收 PCR 产物，Tris_HCl洗脱；参照电泳初步定量结果，将 PCR 产物用QuantiFluorTM-ST 蓝色荧光定量系统(Promega 公司)进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。构建Miseq文库，进行Miseq测序，统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。Miseq测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样本后进行粪便样本中微生物组成分析比较。

本研究通过Beta多样性分析对PD组和对照组微生物群落物种组成的差异性进行比较分析。应用α多样性指数对两组粪便样本中微生物多样性进行分析，包括Sobs、Chao、Shannon、Simpson指数。Sobs指数和chao指数分别是实测和估计的样本中所含OTU数目，常用来估计物种总数。Simpson和Shannon都是用来估算样本中微生物多样性的指数。Simpson指数值越大，微生物群落多样性越低；Shannon值越大，说明群落多样性越高。

1.3PD组和对照组粪便样本中SCFAs的浓度标准品原液以1 mg/mL甲基叔丁基醚(MTBE，CNW Technologies, Germany)的浓度配制。所有的储备溶液储存在-20 ℃。分析前用MTBE稀释原液至工作液。称取样本20 mg于2 mL EP管中，加入1 mL磷酸(0.5% v/v)溶液，加入一颗小钢珠，20 Hz下球磨仪10 s，重复2次，涡旋10 min混匀，冰浴下超声5 min后12 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，取上清液100 μL加入500 μL含内标的MTBE溶剂，涡旋3 min。冰浴下超声5 min；之后在12 000 r/min、4℃条件下离心10 min；离心完后吸取上层清液200 μL到编号有玻璃内衬管的进样瓶中，-20 ℃冰箱保存，待GC-MS/MS分析。

采用Agilent 7890B-7000D气相色谱-质谱联用仪，DB-5MS柱(30 m长× 0.25 mm内径× 0.25 μm膜厚，J&W Scientific, USA)，进行GC-MS/MS分析。载气为氦气，流速为1.2 mL/min。柱箱升温程序：90 ℃升温1 min, 25 ℃/min升温至100 ℃，20 ℃/min升温至150 ℃，0.6 min, 25 ℃/min升温至200 ℃，0.5 min，运行3 min。所有样品均采用多反应监测模式进行分析。前进样口温度为200 ℃，传输线温度为230 ℃，离子源温度为230 ℃。检测样本中乙酸、丙酸、丁酸等SCFAs的水平。

2 结 果

2.1 PD组和对照组微生物多样性分析PD组和对照组粪便样本中微生物群落组成差异有统计学意义(R=0.266,P=0.002)，见图1。H-Y 1、2级和H-Y 3级PD患者肠道微生物群落组成差异没有统计学意义(R=0.053,P=0.670)。

图1 PD组和对照组肠道微生物Beta多样性分析

与对照组相比，PD组粪便样本中OUTs数量Sobs指数及Chao指数明显降低(P<0.05)，见表2。H-Y 1、2级和H-Y 3级PD患者粪便样本OUTs数量Sobs指数、丰度Chao指数、群落多样性Shannon指数和Simpson指数差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表2 入组患者PD组和对照组微生物群落丰度和多样性分析

表3 H-Y不同级PD患者微生物群落丰度和多样性分析

2.2PD组和对照组微生物分析比较与对照组比较，PD组变形菌门明显升高(P=0.037)。其中韦荣球菌科(厚壁菌门，P=0.031)和瘤胃菌科(厚壁菌门，P=0.009)、双歧杆菌科(放线菌门，P=0.019)丰度明显高于对照组(P<0.05)，氨基酸球菌科(厚壁菌门)显著低于对照组(P=0.008)，见图2。H-Y 3级PD患者肠道微生物群中拟杆菌门明显高于H-Y 1-2级PD患者(P=0.043)，科水平微生物在两组间差异没有统计学意义(P>0.05)。

*P<0.05、**P<0.01

2.3PD组与对照组粪便中SCFAs分析PD组粪便样品中丙酸的绝对浓度、乙酸的相对浓度较对照组显著下降(P<0.05)，丁酸水平差异无统计学意义(P>0.05)。H-Y3级PD患者粪便样本中乙酸的绝对浓度明显高于H-Y 1、2级PD患者(P=0.036)，乙酸的相对浓度及丙酸、丁酸在不同H-Y分级的PD患者间差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 PD组与对照组粪便样本中中乙酸、丙酸、丁酸的浓度

3 讨 论

PD的主要病理变化是黑质多巴胺能神经元的选择性、退行性死亡，残存的神经元细胞质内存在包涵体即Lewy bodies(LBs)，其主要成分是异常聚集的α-syn[12]。PD相关的α-syn的聚集出现在胃肠神经元，早于运动症状发展的数年，这提示胃肠道神经元可能是α-syn聚集的起始位置，通过神经纤维逐渐扩散到脑内神经元[13-14]。过表达α-syn的小鼠移植PD患者的肠道微生物比移植正常人菌群更大程度上增加了小鼠肢体障碍，这些发现无疑表明了肠道微生物是PD发生的危险因素[11];同时PD患者的胃肠道症状总是在运动症状之前，这些证据支持了PD病理可能从胃肠道逐渐扩展到脑的。

本研究通过对PD组和年龄匹配的对照组肠道微生物菌群进行分析，发现PD组的肠道微生物菌群多样性明显低于年龄匹配的对照组，同时菌群组成存在明显差异，这与目前大多数相关研究结果一致，然而这些研究的组间微生物种类差异分析存在较大差异。本研究结果显示厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门细菌在两组间没有明显差异，变形菌门在PD组中明显增加。研究显示与对照相比较PD患者拟杆菌门细菌明显降低[7, 11]，而有研究显示PD患者拟杆菌门明显升高，厚壁菌门、变形菌门在不同研究中的变化趋势也不一致[15-16]。两组间微生物种类在科水平进行分析时同样发现丰度前10位的微生物菌群的变化在各项研究中也存在差异[17]。虽然这些差异性的特定微生物在PD的病理过程中的作用目前仍不清楚。但越来越多的研究证明了肠道微生物群在PD的发生发展中发挥着重要作用，肠道微生态治疗切实可行，有着较为理想的临床结局，这将为PD的早期干预及治疗提供依据[18]。

肠道微生物能合成多种神经递质，其代谢产物SCFAs进入中枢神经系统具有神经活性的特性，确切作用机制尚不清楚[19-21]。其中乙酸、丙酸和丁酸是其主要成分。大量的研究表明在正常生理状态下，SCFAs通过参与调节神经递质的合成和受体表达、机体代谢、神经可塑性、脑功能等多种生理过程，发挥正向作用。而在肠道微生物群发生变化，SCFAs则会通过调节炎性因子从而参与神经炎症等病理过程。SCFAs对关键的神经和行为过程存在广泛影响，可能参与神经发育和神经退行性疾病的关键阶段[20-21]。本研究发现PD组与对照相比，粪便样品中丙酸的绝对浓度显著下降，乙酸的相对浓度显著下降，PD患者早期症状中便秘的形成，可能与下降的SCFAs对肠蠕动产生了负向影响具有相关性[22]。

本研究对不同H-Y分级的PD患者肠道样本中的肠道微生物及SCFAs进行了比较分析，PD组不同H-Y分级的患者粪便中的微生物和SCFAs也存在一定的差异，然而本研究纳入病历有限，不同病程和严重程度的PD患者肠道微生物及其代谢产物SCFAs的变化有待更多的研究证实。对PD病理中肠道微生物群及其代谢产物发挥作用更为深入的研究，将为PD提供新的预防和治疗选择。