胶体金免疫层析法直接快速检测阳性血培养标本碳青霉烯酶的效果评价

王卫萍，王 颖，周志涛，吴文琦，吴美琳，徐日蕾，武存霞，吴秀文，赵 云，任建安

0 引 言

当前细菌耐药已成为感染性疾病诊治的重大挑战。多重耐药菌尤其是碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌(carbapenem-resistant enterobacteriaceae, CRE)引起的后果最为严重，包括病程迁延、住院时间延长、病死率上升、住院费用增加等，常成为患者死亡的直接因素[1]。

碳青霉烯类抗生素通常作为治疗多重耐药菌感染的“最后手段”。随着碳青霉烯类药物在临床的广泛应用，肠杆菌目细菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率呈逐年快速上升趋势，导致临床医师经常面临“无药可用”的尴尬处境[2]。产碳青霉烯酶是肠杆菌目细菌对碳青霉烯类药物耐药最主要的机制。因此，准确、快速地检测碳青霉烯酶并分型，对于临床抗感染治疗的早期诊断、精准用药、控制院感和改善患者预后具有重要的价值[3]。

当前实验室检测碳青霉烯酶的方法分为表型和基因型检测。传统表型检测，如Carba NP试验、改良碳青霉烯灭活试验(mCIM)、乙二胺四乙酸(EDTA)改良碳青霉烯灭活试验(eCIM)等虽然操作简便，但无法具体鉴定碳青霉烯酶型。基因检测如实时荧光定量PCR、多重PCR、基因芯片等能够较好地对碳青霉烯酶进行分型，但需要特殊仪器，且检测时间长、操作繁琐，不能满足临床早期快速诊断的需求。胶体金免疫层析法利用特异性抗原抗体结合反应，通过免疫层析显色原理可具体检测碳青霉烯酶型。此项技术具有操作简便及结果易于判读等优点。目前此方法直接快速检测阳性血培养标本碳青霉烯酶的敏感度和特异度研究鲜有报道，其效能尚需进一步评价[4]。本研究旨在针对这一技术进行效果评价，以期为临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源收集东部战区总医院2022年3月至6月期间收治88例住院患者血培养生长肠杆菌目细菌的非重复标本，剔除生长2种及以上细菌的标本，共计88份。

1.2主要仪器与试剂ProFlex PCR扩增仪(赛默飞世尔科技有限公司)，凝胶成像仪(上海培清科技公司)，高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技有限公司)，BACTEC FX血培养仪及其配套的BACTEC Plus Aerobic/F需氧瓶和BACTEC Lytic/10 Anaerobic/F 厌氧瓶(美国BD公司)，VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定系统(法国生物梅里埃公司)，革兰阴性细菌鉴定卡(VITEK 2 GN)(法国生物梅里埃公司)，革兰阴性细菌药敏卡(VITEK 2 AST-GN09)(法国生物梅里埃公司)，NG-Test CARBA 5碳青霉烯酶检测试剂盒(胶体金免疫层析法)(法国NG Biotech公司)，NG-Test Blood Culture Prep样本释放剂(法国NG Biotech公司)，哥伦比亚型增菌培养基(赛默飞世尔科技有限公司)，Gelred核酸染料(美国Biotium公司)，EmeraldAmp MAX PCR Master Mix(宝日医生物技术有限公司)，DL2000 DNA Marker(宝日医生物技术有限公司)，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3培养分离菌株的鉴定药敏试验及酶型检测按血培养仪标准操作程序将血培养瓶放入培养箱。仪器报警阳性后，立即取下血瓶，抽取瓶内培养液转种哥伦比亚型增菌培养基，接种后平板置35 ℃，5%CO2培养箱孵育过夜，同时将培养液直接涂片革兰染色镜检，镜检结果立即通过电话和LIS系统同时报告临床。厌氧瓶阳性加种培养基放置厌氧环境培养。培养的纯菌落用VITEK 2-Compact全自动系统进行鉴定(VITEK 2 GN卡)及药敏实验(VITEK 2 AST-GN09卡)。

用接种环挑取培养过夜菌落置于含有150 μL提取缓冲液的EP管中，涡旋振荡器混合振荡10 s使之混匀(如果菌落样本较黏稠，可适当延长振荡时间)，室温下静置10 min。吸取100 μL制备好的混合液滴入NG-Test CARBA 5试剂条加样孔，于室温下放置15 min，读取结果。

1.4阳性血培养标本的酶型检测直接抽取1 mL阳性血培养瓶中的培养液置于含有1 mL裂解缓冲液的EP管中，涡旋振荡20 s或转动EP管至少5次进行混合。13 000 r/min转速离心5 min，弃上清，此时EP管底部可见白色沉淀物。用1 mL洗涤缓冲液洗涤沉淀，涡旋振荡20 s。13 000 r/min再离心5 min，弃上清，得到富集的细菌样本。再加入150 μL提取缓冲液，涡旋振荡10 s使之混合均匀，室温下静置10 min。吸取100 μL制备好的混合液滴入NG-Test CARBA 5试剂条加样孔，于室温下放置15 min，根据试剂盒说明书读取结果。

1.5PCR检测方法使用接种环挑取培养过夜纯菌落置于含有800 μL无菌去离子水的EP管中。在100 ℃水浴锅中加热煮沸10 min，12 000 r/min离心10 min，吸取上清液分装到新EP管中，作为PCR的模板。本研究设计了5种常见的碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaOXA、blaNDM、blaVIM和blaIMP)引物、反应体系及扩增条件，均见参考文献[5]。扩增产物于100 V的1%琼脂糖凝胶中电泳30 min后，于凝胶成像仪中拍照分析。

以PCR检测结果为金标准，对胶体金免疫层析法检测阳性血培养标本及培养分离菌株碳青霉烯酶的敏感度和特异度进行评价。

2 结 果

2.1 菌株分布88份血培养为肠杆菌目细菌标本中60份来自普通外科，11份来自急诊科，6份来自肾脏病科，4份来自呼吸内科，3份来自神经外科，骨科、泌尿外科、消化内科和中医科各1份。88份培养分离出肺炎克雷伯菌54株，大肠埃希菌22株，奇异变形杆菌7株，阴沟肠杆菌4株和产气克雷伯菌1株。

2.2药敏结果88株肠杆菌目分离株耐药情况见表1。碳青霉烯类抗生素(亚胺培南、美罗培南)耐药率最高为肺炎克雷伯菌(70.4%)，其次为阴沟肠杆菌(25.0%)，再次为大肠埃希菌(9.1%)，奇异变形杆菌和产气克雷伯菌均未检出耐药株。

表1 88株肠杆菌目细菌对常用抗菌药物的耐药率

2.3碳青霉烯酶基因检测结果88株肠杆菌目细菌检测出blaKPC基因28株，blaOXA基因6株,blaNDM基因2株，blaKPC+blaNDM基因3株，blaKPC+blaOXA基因2株。其中肺炎克雷伯菌检出blaKPC27株、blaOXA6株、blaKPC+blaNDM3株、blaKPC+blaOXA2株，大肠埃希菌检出blaNDM2株，阴沟肠杆菌检出blaKPC1株。PCR检测结果见图1。另47株菌未检测到上述5种常见的碳青霉烯酶基因。

图1 部分PCR产物电泳结果

2.4胶体金免疫层析法检测结果

2.4.1 阳性血标本直接检测结果88份阳性血标本直接检测出酶型为 KPC 29份、酶型为OXA 6份、酶型为NDM 2份、酶型为KPC+NDM 2份和酶型为KPC+OXA2份，共计41份，未检出VIM和IMP酶型。其余47份阳性血培养标本均未检测出KPC、NDM、VIM、IMP和OXA碳青霉烯酶，见表2。

2.4.2培养分离菌株的检测结果培养分离菌株的胶体金免疫层析法检测结果与直接利用阳性血培养标本的检测结果一致，见表2。

2.4.3与PCR结果对比分析以PCR检测为金标准，NG-Test CARBA 5试剂盒直接利用阳性血培养标本快速检测碳青霉烯酶的敏感度为97.6%，特异度为100%。单一酶型NG-Test CARBA 5检测与PCR检测结果一致。双酶型检测时，在KPC+NDM双酶型的识别上敏感度较低，为66.7%，NG-Test CARBA 5部分菌株仅可检测出一种酶型，存在漏检NDM情况，见表2。

表2 采用PCR法和胶体金免疫层析法检测结果对比

3 讨 论

多重耐药菌引起的血流感染是造成患者死亡的独立危险因素[6]。根据已发布的中国细菌耐药监测网的数据，大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率逐年上升[7]。2020年我国CRE的比例为10.7%，其中肺炎克雷伯菌耐美罗培南的比例达到24.2%，2021年则升至24.4%。CRE在危重患者中的比例更高，在2015-2018年亚太地区腹腔感染的832份细菌分离株中，共检出CRE 122株，其中肺炎克雷伯菌占比67.2%，大肠埃希菌占比21.3%[8]。在东部战区总医院的一项回顾性研究中，收集来自2008-2015年502例严重腹腔感染与消化道瘘患者的874份菌株，其中肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌分别占比14.1%和24.2%，两者对亚胺培南耐药率分别为60.16%和20.56%，其中对亚胺培南耐药的大肠埃希菌比例从2008-2011年的14.3%增加到2012-2015年的25.9%[9]。因此如何防治CRE所致血流感染已成为现代医疗迫切需要解决的问题。

早期针对性地使用抗生素可明显改善患者的预后。有研究表明，在6 h内接受抗生素治疗的脓毒症患者中，每延迟1 h给药时间，相关死亡率增加0.3%[10]。目前临床感染标本的培养鉴定及药敏结果通常需要48～72 h，在此之前临床医师只能凭借症状体征和其他相关检查结果采取经验性用药或广谱抗生素疗法；但是不恰当的初始疗法不仅会增加患者死亡的风险，还会诱导细菌耐药，导致临床管理难度和院内感染比例的增加[11]。

按照Ambler分子分类方法，碳青霉烯酶可分为A、B和D 3类[12-13]。A类为丝氨酸碳青霉烯酶，以KPC、SME、IMI、NMC和GES型为主；B类为金属β-内酰胺酶，以NDM、IMP、VIM、GIM和SPM型为主；D类为OXA-48型丝氨酸碳青霉烯酶。目前美国FDA(食品药品监督管理局)已陆续批准多种新型β-内酰胺类/β-内酰胺酶抑制剂复合制剂上市，包括头孢他啶/阿维巴坦、美罗培南/法硼巴坦、头孢洛扎/他唑巴坦和亚胺培南/西司他丁/雷利巴坦[14]。新抑制剂阿维巴坦、法硼巴坦和雷利巴坦对超广谱β-内酰胺酶(ESBL)、KPC 酶等均有较强的抑制活性，但对B类金属酶无抑制作用[15]。目前碳青霉烯酶检测技术手段多样[16]。表型检测方法有Carba NP、改良碳青霉烯灭活试验、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)等，基因型检测方法包括荧光定量PCR法如GeneXpert和胶体金免疫层析法。尽管碳青霉烯酶检验流程在不断优化改进以提高检出效率，但仍然要建立在细菌分离鉴定的基础之上。与传统的检验技术相比，胶体金免疫层析法是目前碳青霉烯酶型检测技术中最快速便捷的方法[17]，操作简单，无需特殊专业技能，试剂盒体积小巧，携带方便，无需配套专业仪器，极大缩短报告时间，在微生物检测中具有广阔的应用前景。目前该方法适用于培养分离菌株或阳性血培养样本，但是分离菌株需要过夜孵育培养(18～24 h)，导致检测结果延迟。而直接利用阳性血培养标本，预处理后再经胶体金免疫层析法检测，不需要分离纯化单个菌落，极大程度上缩短了检验标本周转时间(Turn-around time，TAT)，为临床诊断和治疗决策争取了宝贵的时间。

目前胶体金免疫层析法直接快速检测阳性血培养标本碳青霉烯酶的敏感度和特异度研究较少，其效能尚需进一步评价。现有的研究表明，胶体金免疫层析法检测阳性血培养中CRE酶型的特异度可达100%，但由于实验条件、实验步骤存在差异，敏感度仅为79.3%，且总体样本量较少[18]。本研究在以往的实验基础上将阳性血培养标本的预处理流程进行改进，优化了具体的操作步骤和实验条件，为基层医院实验室、急诊检验科及其他国内研究工作者开展类似检验工作提供了参考，有助于临床上直接利用阳性血培养标本快速检测碳青霉烯酶，并形成一套完整的标准操作程序。

本研究共收集东部战区总医院2022年3月至6月血流感染患者肠杆菌目细菌阳性血培养标本88份，利用NG-Test CARBA 5试剂盒分别对血培养标本和培养分离菌株进行碳青霉烯酶型检测，发现无论是单一酶型还是双酶型，血培养标本和培养分离菌株的检测结果均一致，并与PCR结果高度符合，总体敏感度和特异度达到97.6%和100%，但在KPC+NDM双酶型的识别上敏感度较低，为66.7%。在本次研究中，全院阳性血培养标本中CRE占比46.6%，肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素(亚胺培南、美罗培南)的耐药率为70.4%，显著高于全国平均水平，因此在CRE的治疗及感控问题上需引起重视。

综上，胶体金免疫层析法在临床耐药菌碳青霉烯酶的鉴定和识别上提供了新的思路，其高灵敏度和高特异性的优点可以加快血流感染患者的临床检测流程，提高CRE耐药酶的检测效率，可用以辅助医疗工作者早期快速诊断，指导抗生素的早期准确使用，有助于抗菌药物的优化管理，从而改善患者的预后，提高生存率，在控制院内感染和减少耐药菌的水平传播上具有重要的意义。