沙地柏根际促生耐寒短杆菌SDB5的分离和功能鉴定

王建武,相微微,陈 花,王一昭,刘 畅,屈香香,王 鹏,尚爱军

(榆林学院 生命科学学院,陕西 榆林 719000)

沙地柏(Sabina vulgaris),又称臭柏,柏科圆柏属的一种灌木,主要分布在中国西北天山、祁连山等地区,其耐干旱贫瘠环境,有较强的适应性,在西北地区被用来防风固沙,净化环境,保持水土,改良土壤等[1]。植物根际促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR),是指生活在根系土壤周围或者在植物根际中附生的有益菌[2]。PGPR 定殖于植物根际系统,有改善土壤,固氮,解磷,促进植物生长,提高作物产量,提高植物耐受性,防治害虫,分泌植物激素等作用,在植物快繁中也具有较大的应用潜力[3-5]。不同种类的PGPR 与不同植物互作产生的促生效果也有很大差异。李永斌等[6]研究发现不同菌株在小麦株高、鲜质量及增产效果上差异较大,其中枯草芽胞杆菌56在减施尿素10%的条件下使小麦产量提高10.4%。吴东升[7]对7种PGPR 研究发现,不同种类的PGPR 在促进西瓜生长、改善元素吸收及品质改良效果上有差异;谢雨歆等[8]发现3种PGPR 混合菌剂可改善烤烟的农艺性状及烟叶的化学品质,同时降低烤烟的发病率。金月波[9]和祝凌云[10]分别发现不同菌株在促进水稻种子萌发、幼苗生长方面都有差异。

土地盐碱化是影响植物生长与作物产量的重要问题之一,目前中国盐碱化土地面积还在逐年增加[11]。土地盐碱化对植物有严重的危害作用。土壤盐碱成分过高会导致土壤p H 增高,影响植物对某些元素的吸收,导致植物缺失营养元素,同时还会造成植物生理干旱,危害植物生长发育;会抑制水稻种子的萌发与生长,影响颖花数量与幼穗分化;会干扰气孔闭合,影响二氧化碳进出与植物的光合作用,导致植物生长发育减缓与产量降低[12-15]。PGPR 在改良土壤,促进植物增产,以及提高作物耐受性和治理土地盐碱化方面,已经表现出独特优势与显著效果[4]。姜焕焕等[16]研究表明,PGPR 通过调节植物盐碱抗性相关基因及蛋白的表达,可以增强植物的抗盐碱能力。添加耐盐碱PGPR 已逐渐发展成一种新的缓解盐碱胁迫的处理方法。刘佳莉等[17]和庞学兵等[18]分别发现具有ACC脱氨酶活性的植物促生菌可促进燕麦和棉苗的生长并提高其盐碱抗性。袁海等[19]研究发现在不同浓度NaCl胁迫下不同种类的芽孢杆菌使植株的株高、地上部及根系鲜质量增加,并降低了玉米叶片的相对电导率。王华笑等[20]和陈小娟等[21]分别发现根际促生芽孢杆菌能增强玉米的耐盐胁迫能力。

利用PGPR 进行土壤改良并促生、增产已经成为农业研究中的一个热点。本试验拟从沙地柏中分离PGPR,对其形态和特性进行鉴定,并在盆栽和大田条件下研究其对水稻种子萌发,植株耐盐碱胁迫及生长、产量等方面的影响,以明确其功能,以期为改良盐碱地,提高盐碱地效益,增加作物产量提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

沙地柏采自陕西省神木市大保当镇沙地柏天然林中,采集其根部,放入自封袋冷藏并带回实验室,保存于4 ℃冰箱,备用。水稻品种选用‘吉宏6号’,由宁夏原种场提供。

1.2 方法

1.2.1 沙地柏内生细菌的分离及鉴定 沙地柏根部表面消毒后进行沙地柏内生细菌的分离与纯化,再进行沙地柏内生细菌的生长特性观察及生理生化鉴定,内生细菌的16S rDNA 序列测定及分析,内生细菌耐盐耐碱测定均参照艾银婷[22]关于沙地柏根际促生细菌玫瑰色考克氏菌SDB9的分离及鉴定的方法。

1.2.2 菌体激素测定 LB 培养基(Luria-Bertani培养基,胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,NaCl 10 g/L)培养细菌1 d后,离心收集菌体,送至中国科学院遗传与发育研究所进行激素含量测定。

1.2.3 水稻种子萌发及植株生理指标测定 (1)

种子萌发率测定:先用1×107cfu/m L 目标菌液和蒸馏水分别浸种48 h后,捞出阴干。选取直径为15 cm 的培养皿32个,铺上滤纸,分别用150 m L 浓 度 为0.02 mol/L、0.04 mol/L 和0.06 mol/L的Na2CO3溶液模拟轻、中、重度盐碱胁迫培养接菌和未接菌的种子各100 粒,重复4 次。14 d后,记录不同处理种子的萌发率,从而确定水稻种子所能耐受的盐碱胁迫浓度。

(2)植株生理指标测定:梯度Na2CO3模拟盐碱胁迫试验发现,重度胁迫下,水稻种子有40%以上能正常出芽生长。选取长为30 cm,宽20 cm,高8.7 cm 的方形花盆,将蛭石与营养土按1∶2 的体积比混合后装盆,每盆装2 kg土。播种,待水稻幼苗高约5 cm 时间苗,每盆留20株,选取24盆幼苗,用1×107cfu/m L 目标菌液和自来水分别浇灌处理12盆(每盆浇灌1 L),即为试验组和对照组。30 d后,对试验组和对照组分别进行3 次盐碱(每盆浇灌1 L 浓度为0.02 mol/L、0.04 mol/L 和0.06 mol/L 的Na2CO3溶液)胁迫,间隔时间为7 d,3次胁迫处理后,继续培养5 d,然后测定对照组和试验组的水稻叶绿素含量及氧化应激生理指标。耐盐碱相关指标测定参照艾银婷[22]的测定方法。

1.2.4 大田试验 (1)试验地概况及试验设计:试验地位于宁夏回族自治区银川市兴庆区兵沟黄河大 桥,地 处38°24′43″N,106°27′24″E,海 拔1 105 m,年平均降水量200 mm,无霜期168 d,年平均有效积温3 300 ℃。土壤类型为潮灌淤土,土壤肥力中等。土壤养分含量为有机质3.22 g/kg,全氮0.21 g/kg,水解氮17.28 mg/kg,速效磷1.19 mg/kg,速效钾40.05 mg/kg。挑选颜色和大小基本一致且饱满的水稻种子1 kg,平均分成两组,分别用1×107cfu/m L 目标菌液和等量清水浸泡过夜,阴干,备用。试验采用随机区组设计,分2个处理:试验组和对照组,每个处理3个重复小区,每个小区面积为20 m2,长5 m,宽4 m,条播播种量为160 g,行距20 cm。四周设4行保护行。以后均按传统水稻种植方式进行管理。10月份水稻成熟后,放干稻田中的水,晾晒1周。

(2)土壤含盐量及p H 测定:在播种前,分别从试验组和对照组的每个小区中部位置取深度为0～20 cm 土壤,参照鲍士旦[23]的方法进行含盐量及p H 测定。

(3)水稻形态指标测定:记录水稻的出苗率及出苗期,并在成熟期选择20个单株测定水稻株高、穗长、穗下茎长、穗基直径、茎基直径等地上部分指标及根长、根面积、根体积等地下部分指标。

(4)水稻产量指标测定:从各试验样地中选择长势均匀的1 m2水稻样本进行采收,测定千粒质量,单位平方米产量,重复3次,取平均值后计算理论产量(换算成14%含水率)。

(5)水稻根部形态指标测定:用根系扫描仪扫描,然后用Win RHIZO PRO 2009 软件(Regent Inc.,Quebec,Canada)进行形态指标的量化处理分析。

1.3 试验数据分析

采用SPSS 19.0与Microsoft Excel 2016软件进行统计分析及作图。

2 结果与分析

2.1 内生细菌的分离及鉴定

2.1.1 内生细菌的形态及菌落特征 从沙地柏根中分离提纯到1株植物根际内生细菌,编号为SDB5,高分辨率扫描结果显示该菌长约为2 667 nm,宽约为906.7 nm,杆状(图1-A),革兰氏染色阳性(图1-B),在p H 7的LB培养基上培养4 d后,菌落呈白色。

图1 内生细菌SDB5的形态鉴定Fig.1 Morphological identification of endophytic bacteria SDB5

2.1.2 SDB5菌16S r DNA 序列分析 以内生细菌SDB5的16S r DNA 序列为探针,登录NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库,进行BLAST 序列比对,结果表明内生细菌SDB5的16S r DNA 序列与耐寒短杆菌Brevibacterium frigoritoleransstrain QT343(登录号MT043730.1)和Brevibacterium frigoritoleransstrain TS20(登录号MN710443.1)16S r DNA 序列的同源性最高(100%),因此内生细菌SDB5被鉴定为耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans)。

2.1.3 SDB5菌耐盐耐碱测定 利用不同盐浓度和p H 的固体LB 培养基,对菌液梯度稀释后进行滴板试验(Drop test)(图2-A,图2-B),结果表明耐寒短杆菌SDB5 能够在浓度为0～1 mol/L NaCl培养基或p H 6～11 培养基上正常生长。在浓度为1.5 mol/L NaCl的培养基上不能生长,在p H 12的培养基上基本不能生长。盐碱复合胁迫与上述单独胁迫结果类似,说明耐寒短杆菌SDB5具有耐盐碱能力,且在酸性(p H 6)条件下也能生长。

图2 耐寒短杆菌SDB5的耐盐碱测定Fig.2 Identification of salt and alkali tolerance of Brevibacterium frigoritolerans SDB5

2.2 菌体激素含量测定

气相质谱测定其激素含量结果表明(表1):SDB5菌株内生长素(IAA)含量为356.90 ng/g,细胞分裂素主要是异戊烯基腺苷(iPR)和异戊烯基腺嘌呤(iP),其含量分别为2.13 ng/g和48.57 ng/g,而反式玉米素类细胞分裂素如反式玉米素(tZ)、反式玉米素核苷(tZR)、和反式玉米素-7-糖苷(t Z7G)含量很少。

表1 SDB5菌体内细胞分裂素(CTKs)和生长素(IAA)含量(¯x±s)Table 1 Contents of cytokinins(CTKs)and auxin(IAA)of SDB5 strain ng/g

2.3 水稻种子萌发及植株形态、生理指标测定结果

2.3.1 种子萌发结果 如表2所示,SDB5菌处理的种子在非胁迫下,14 d 后的发芽率提高4.3%,盐碱胁迫下,14 d 后的总发芽率都有降低;随着Na2CO3浓度的升高,种子的发芽率逐渐降低,但相同胁迫浓度下,SDB5菌处理种子的萌发率高于CK,低盐碱胁迫下,种子的发芽率比CK 高2.1%,中度盐碱胁迫下,种子的发芽率比CK 高4.5%,重度盐碱胁迫下,种子的发芽率比CK 高15.2%,差异显著。结果说明在盐碱胁迫下,SDB5菌能增强水稻种子的萌发率,但重度胁迫使种子的萌发率低于60%,严重影响种子的发芽率。

表2 盐碱胁迫下处理14 d后种子萌发情况统计(¯x±s)Table 2 Statistics of germination rate of seeds under saline-alkali stress after 14 days

2.3.2 水稻形态及生理指标测定结果 (1)盆栽水稻形态比较:从图3可以看出,用菌处理60 d的水稻植株比对照叶片相对较绿,分蘖能力更强。

图3 盐碱胁迫下SDB5处理和CK 水稻表型对比Fig.3 Phenotypic comparison of rice between SDB5 and CK under saline alkali stress

(2)水稻生理指标测定结果:结果如图4 所示:SDB5组叶绿素含量显著高于CK,提高90%(图4-A),超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性高于CK,但差异并不显著(图4-B,图4-C),过氧化氢酶(CAT)活性显著高于CK,提高95%(图4-D),丙二醛(MDA)含量高于CK,但差异不显著(图4-E),脯氨酸含量显著高于CK,提高73%(图4-F)。

图4 盐碱胁迫下SDB5处理和CK 水稻氧化应激生理指标测定结果Fig.4 Determination of physiological indexes of rice oxidative stress in SDB5 treated and CK under saline-alkali stress

2.4 大田试验结果

2.4.1 水稻出苗及形态指标测定结果 如表3所示:耐寒短杆菌SDB5组与CK 相比,水稻出苗期没有明显变化,但出苗率提高20%,株高增加3.8%,穗长增加12.4%,穗下茎增长3.9%;茎基直径增加2.9%,穗基直径增加48%,穗基直径、穗长差异显著,株高、穗下茎长、茎基直径差异不显著;根部形态指标中侧根数量明显增多,根长增加43%,根表面积增加46%,根系体积增大33%。2.4.2 水稻产量指标测定结果 由表4可知,与CK 相比,SDB5组的穗实粒数增加33.3%,差异显著;水稻理论产量为622 kg,CK 理论产量为527 kg,增产18.2%。

表3 SDB5与CK 水稻形态指标测定结果(¯x±s)Table 3 Morphological index results of SDB5 and CK rice

表4 SDB5与CK 水稻产量指标测定结果(¯x±s)Table 4 Results of rice output indexes of SDB5 and CK

3 讨论

植物内生菌的分离及应用可以针对同种植物,如王秋平[24]和韩笑[25]对水稻根际内生菌的分离及应用,也可以针对不同种的植物,如袁东[26]将月季来源的内生耐盐菌株应用到水稻中。笔者所在团队则是从陕北抗逆性极强的沙地柏根际中分离出两株内生促生菌,一株鉴定为玫瑰色考克氏菌(Kocuria rosea),命名为SDB9[22,27],另一株即为本试验的研究对象,鉴定为耐寒短杆菌,命名为SDB5[28]。研究发现,SDB5菌的耐盐碱性虽然低于SDB9[22,27],但在p H 11,1 mol/L NaCl条件下能生长,说明耐盐碱性较强。虽然两个菌株来源相同,但菌体内激素含量有明显差异,SDB5菌株内IAA(生长素)含量为356.9 ng/g,比SDB9菌体内IAA 含量低95.4%,细胞分裂素主要成分相同,反式玉米素类细胞分裂素含量均很少,但异戊烯基腺苷(iPR)含量为2.13 ng/g,比SDB9菌少92.6%,而异戊烯基腺嘌呤(iP)为48.57 ng/g,比SDB9菌高33.4倍[20,25]。说明即使来源相同的不同菌株在分泌激素方面,如生长素、细胞分裂素等,种类及含量均存在较大差异,促生机理也应存在较大差异。

在梯度Na2CO3模拟盐碱胁迫下,SDB5 菌能提高水稻的萌发率并能显著提高水稻中叶绿素含量,增强水稻光合作用,这与前人对根际促生菌的研究结果相一致[23-25]。SDB5菌能使水稻叶片中氧化应激酶SOD、POD、CAT 活性增加,其中CAT 活性显著增加,SOD 和POD 活性稍微增加,但与对照差异不显著;这些抗氧化酶活性的增强,减少了水稻中活性氧的积累,促进了植株的正常生长。脯氨酸含量显著增加,说明SDB5菌能诱导植物提高脯氨酸含量来抵御外界环境胁迫。MDA 含量稍微增加,但与对照差异不显著。综上,说明耐寒短杆菌SDB5可以提高水稻植株的耐盐碱性,主要是通过减轻盐碱胁迫对叶绿素合成的抑制、诱导渗透胁迫调节物质脯氨酸的增加,来提高水稻耐盐碱性,这与前人对PGPR 的研究结果相一致[26]。有些研究表明PGPR 能在正常生长条件下增强植物抗氧化酶的活性,但胁迫下抗氧化酶活性降低[24-25],与本试验结果不一致,原因可能是不同内生菌对植物氧化应激能力的影响有差异,具体机理还需进一步研究。

大田试验条件下,在p H 8以上的碱性土壤中,接种SDB5菌水稻植株地上及地下生物量均增加:穗基直径及穗长显著增加,根长、根表面积及根体积也显著增加。对经济性状而言,千粒质量稍有降低,穗实粒数增加,理论产量提高18.2%,增产效果显著。上述研究进一步证明在盐碱化土壤中,SDB5 菌能成功定殖到水稻根部并发挥促生、增产作用。

4 结论

本试验从沙地柏根中分离到1株耐寒短杆菌SDB5。该菌株内IAA(生长素)和细胞分裂素中的异戊烯基腺嘌呤(iP)含量较高,而反式玉米素类含量很少。该菌能够在浓度0～1 mol/L NaCl培养基或p H 6～11培养基上正常生长。盐碱复合胁迫与上述单独胁迫结果类似,说明该菌有耐盐碱能力。梯度Na2CO3模拟盐碱胁迫下,该菌能使水稻萌发率提高,叶绿素含量、CAT 活性、脯氨酸含量均显著提高,说明该菌能增强水稻的耐盐碱性。大田试验结果表明:在土壤含盐量0.22%,p H 8.4轻度盐碱地上,该菌能使水稻地上和地下部分生物量增加,尤其是穗基直径显著增粗,穗长、根长、根面积、根体积显著增加,水稻理论产增加18.2%,证明SDB5菌不仅促进水稻生长还能提高水稻产量。综上所述,沙地柏的内生耐寒短杆菌SDB5可以提高水稻耐盐碱性,并在盐碱条件下,使水稻的生长势增强,产量提高。

本研究成功分离了耐寒短杆菌SDB5,并证明其在盐碱条件下,对水稻有促生、增产效果,这一研究结果为开发新型微生物菌剂,提高盐碱地效益,促进农业可持续发展提供了新的途径。