野生蓝莓根际真菌群落特征研究

杨秀丽

(呼和浩特职业学院医药卫生系，内蒙古 呼和浩特 010051)

野生蓝莓为杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium spp.)多年生落叶或常绿灌木型果树，因果实多呈现蓝色，所以通常称为蓝莓(Blueberry)。越橘属植物分布广泛，从热带一直到北极圈都有，全属计约300种以上，但集中分布于东南亚热带高山、东亚温带和亚热带、中南美洲以及北美东部4个地区[1]。越桔属植物在我国约产65种，集中分布于西南几省，特别是云南分布的种类约占全国1/2左右，但大多数种类尚未发现其经济利用价值。有利用价值的除乌饭树(Vaccinium.sprengelii Sleumer)分布较广，在11个省有零星分布以外，笃斯越橘(Vaccinium uliginosum L)、红豆越橘(Vaccinium vitis-idaea L.)和蔓越橘(Vaccinium macrocarpon L.)都局限于东北地区，蕴藏量相当大，有开发利用价值[2]。其中，笃斯越橘经济利用价值最高，在当地被林区被林区人们开发成多种特色产品，具有可观的经济收益。而且笃斯越橘耐寒性极强，可抵御-50℃的低温，是森林中天然生长的野生水果资源[3]。大兴安岭素以高寒著称，被认为是水果栽培的禁地，而野生笃斯越橘(野生蓝莓)却生长繁茂，如果能对其有效的开发利用，对本地经济有积极的补充作用。

对蓝莓的研发近年来也逐渐受到关注，本研究对大兴安岭地区野生蓝莓根际土壤真菌的多样性情况进行调查研究，拟对本地区野生蓝莓的资源保护、开发、利用提供本底数据。

笔者曾对本地区野生蓝莓的菌根及其真菌进行了研究，因野生蓝莓与菌根菌形成了广泛的互惠共生体——菌根。野生蓝莓根系呈纤维状，没有根毛，但在自然状态下，野生蓝莓根系与菌根真菌共生形成杜鹃类菌根(Ericoid mycorrhiza ERM)，又称殴石楠类菌根。ERM在促进植物生长、提高养分吸收率、生态系统养分循环及保护植物抵御不良环境胁迫中起关键作用[4-6]。许多与野生蓝莓形成的菌根都被证明能促进越橘对矿物质营养元素的吸收和利用，改善植株营养状况，调节宿主的代谢活性，增强植株的抗逆性，提高越橘的产量，加快移栽苗成活速度，节约农业生产成本，增加经济产量和效益。因此对其菌根菌的研究很有必要。可笔者在研究过程中，发现传统培养法无法准确反映野生蓝莓根际菌根菌和土壤中其他真菌的真实情况，因为很多真菌传统方法培养不出来。

随着核酸测序的快速发展，尤其是高通量测序技术的出现，拓展了人们对环境微生物的认识，使其成为对难以培养微生物或不可培养微生物群落研究的技术策略，能够让人们直接从环境中获取总DNA，并对其进行测序分析[7]，从整体水平上尽可能揭示根际真菌的群落结构及多样性。本研究也采用了高通量测序技术对野生蓝莓根际真菌群落特征进行分析研究，得到了较全面的野生蓝莓越桔根际真菌的群落数据。

1 材料和方法

1.1 样品采集

试验区位于内蒙古大兴安岭森林生态系统国家野外科学观测研究站(以下简称大兴安岭森林生态站)。该站是国家林业局中国森林生态系统定位研究网络(CFERN)和科技部国家野外科学观测研究网络(CNERN)的站点成员，是我国纬度最高的、也是寒温带地区唯一的国家级森林生态系统定位研究站。该站地理坐标为N50°49′～50°51′，E121°30′～121°31′。

在大兴安岭森林生态系统定位站附近原始林区选取有代表性的野生蓝莓群落，采样方法为5点法。采集野生蓝莓根和根际土壤6份地表以下10～30cm的土层，混合为1个样本，每个样本30g。经4.5mm孔径筛网进行过滤掉植物残留物和颗粒，放入-20°C的冰箱保存[8]。

1.2 DNA提取

样本取30g，利用Power Soil DNA TM extraction kit(MoBio Laboratories Inc.,Carlsbad,CA,USA)试剂盒提取。操作依据说明书进入网站查询(http://link.springer.com/article/10.1007/s10482-011-9624-8)。

采用引物ITS5-1737F：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG；ITS2-2043R：GCTGCGTTCTTCATCGATGC进行扩增。

采用 Illumina HiSeq测序平台得到的下机数据，称之为Raw PE，然后进行拼接和质控，得到Clean Tags，再进行嵌合体过滤，得到可用于后续分析的有效数据，即Effective Tags。

1.3 测序

北京诺禾致源生物信息科技有限公司代为测序。根据所扩增的各区域特点，开发适用于该区域的数据质控的软件Microbial-weijie。完成建库后利用MiSeq测序平台测序，运用软件Microbial-weijie对产生的测序数据进行数据质控。

建库测序：基于Illumina Miseq技术测序平台，构建小片段文库进行双末端测序(Paired-End)。

1.4 数据分析

将得到的优化序列通过聚类分析获得OTUs,按相似度97%进行OTU(Operational Taxonomic Units)的聚类，选取每个类最长的序列为代表序列然后调用RDP—classifier的方法，以RDP数据库的序列为训练集对OTU代表序列进行注释，最终得到每个OTU分类学信息。

利用Qiime软件对所有序列进行随机抽样，以抽取到的序列数与其所能代表OTU的数目构建稀释曲线，同时计算样品中的真菌群落丰富度指数Chao1和多样性指数Shannon指数。

2 结果分析

2.1 测序结果

根据高通量测序结果对序列进行统计，见表1，测序共获得clean reads 24090个,从样本中获得的优质序列长度分布在188～388bp，其中碱基数大于198bp的获得优质序列24082条。

表1 获得的序列情况

2.2 OTUs(operational taxonomic units)分析：OTU分析和物种注释

为了研究样品的物种组成多样性，对所有样品的过滤嵌合体后，最终用于后续分析的Effective Tags进行聚类，以97%的一致性(Identity)将序列聚类成为OTUs(Operational Taxonomic Units)，然后对OTUs的代表序列进行物种注释。基于97%的相似度水平，共获得282个OTUs利用reads。

OTUs稀释曲线来评估样本的测序数据量是否足够从稀释曲线可以看出，见图1,样本的稀释曲线均趋于平缓，说明测序趋于饱和，测得的数据可以反映土壤根际真菌群落的真实情况。

图1 样本的稀释曲线

2.2.1 样品中界门纲目科属种情况

从样品中共获得有效序列17575条，在门水平上共得到14374条序列，占总序列81.787%，在属种水平上共获得序列14030条，占总序列的79.829%。

表2 界门纲目科属种(k,p,c,o,f,g,s)水平上的Tags数目统计表

2.2.2 样品的Tags及OTUs(operational taxonomic units)数目统计表

从样品中获得的有效序列总数为17575条，可以分类的序列数为15661条。获得的操作分类单元(OTUs)282个。

表3 样品的Tags及OTUs数目统计表

2.2.3 样品中的真菌在门水平上的分类情况

282个OUTs分属于真菌领域的3个门和4个潜在的菌门和其它未分类菌门。其中属于子囊菌亚门的最多，占比0.707。

表4 样品中的真菌分门统计表

2.2.4 样品中占比前10的属情况

样品中14030个序列被确定分属于165个属，其中排名前10的属见表5。Sordariomycetes属真菌最多，占比0.275。

表5 样品中的真菌分门统计表

2.2.5 单样品中特定物种分类树

样品中的真菌，在分类树上聚为4大类，子囊菌为最大的一类，占52.238%，担子菌为第2大类，占6.508%，见图2。

图2 物种分类树

2.3 样品的Alpha多样性分析

采用Alpha多样性指数中的香农指数(Shannon index)和Chao1指数对样品序列进行了分析。Chao1指数为277.7771，Shannon为5.6502。

3 结论

从野生蓝莓根部土壤中分离出的真菌隶属于3个门和4个潜在的菌门和其它未分类菌门，分属于165个属。排位在前10的属分别为Sordariomycetes，Fusarium，Russula，Cephalotrichum，Trichoderma，Alternaria，Eupenicillium，Suillus，Un--s-fungal endophyte，Un--s-Ascomycota。

图3 Chao1指数图 图4 Shannon指数图

Alpha多样性指数选择香农指数(Shannon index)和Chao1指数对样品序列进行了分析。样本的丰富度指数Chao1表明样品中真菌丰富度水平较高，多样性指数Shannon表明样品中多样性水平较高。

以DNA测序技术为基础的新一代高通量测序技术使得对野生蓝莓根际真菌群落的研究更全面直观，比用传统方法能探查到的真菌种类多得多。这与之前学者研究结果相似，即使用传统培养法无法准确反映土壤中真菌的真实情况[9]，传统方法仅能反映占土壤真菌总量的1%的可培养真菌的状况，常用的克隆文库分析则存在耗时耗力、通量低、分辨率低等的不足[10]。相对于传统的培养法以及克隆文库等常规的分子生态学研究方法，高通量测序明显拥有通量高、获得信息丰富、快捷等优势[11]。

而且与笔者之前用传统方法研究得出的结果相比较，本次从野生蓝莓根际土壤中探查到165个属的真菌，而传统方法从野生蓝莓根样中分离得到的真菌分为6个类群：膜盘菌属(Hymenoscyphus)真菌，Phialocephala真菌，粒毛盘菌属(Lachnum)真菌，Cadophora真菌，担子菌小皮伞属(Marasmius),担子菌小菇属(Mycena)[12]。

这165个属的真菌哪些是与笃斯越桔菌根有密切关系的类群，还需要进一步的研究。