新对叶百部碱对肺炎支原体肺炎小鼠肺组织致咳因子TRPA1表达的影响

梁 爽，蒙艳丽，刘 畅，王晓溪，王 博，王伟明

(黑龙江省中医药科学院·黑龙江 哈尔滨 150036)

新对叶百部碱(neotuberostemonine，NTS)是对叶百部的主要的活性成分，具有止咳、改善肺损伤和肺纤维化等作用[1-2]。相关的研究表明，具有饱和的三环结构是其止咳镇咳药理活性所必须条件。Zhou等[3]研究了新对叶百部碱、对叶百部碱、对叶百部碱H和对叶百部J的体内止咳活性，发现3种百部生物碱对枸橼酸诱发的咳嗽豚鼠均有显著的止咳作用。

TRPA1蛋白是瞬时受体电位离子通道蛋白[4]，存在于肺部的表面神经末梢，当刺激性物质或病原体伴随空气通过呼吸进入肺部时，TRPA1蛋白将会被激活，引起Ca2+通透性改变后进入细胞内产生一系列效应，导致咳嗽发生[5]。本文旨在研究新对叶百部碱对肺炎支原体肺炎小鼠肺组织TRPA1咳嗽因子的影响，旨在为其治疗支原体肺炎提供实验室依据。

1 材料

1.1 药品 新对叶百部碱标准品：成都瑞芬斯生物科技有限公司，批号：RFS-X07901904009,规格20 mg,加去离子水配制成0.015 g/L的溶液，储存在-4 ℃备用。阿奇霉素分散片：石药集团欧意药业有限公司，批号：274150404，规格：0.25 g×6片×2板/盒。枸橼酸喷托维林：上海玉瑞生物科技(安阳)药业有限公司，批号：190305，规格：25 mg×100 s。

1.2 实验动物 6周龄C576BL小鼠50只，体质量20～22 g，雄性，购于哈尔滨医科大学实验动物学部，动物许可证号：SCXK(黑)2009-001。饲养于室温25 ℃和湿度60%的GLP实验室中。保持每日通风情况良好，环境舒适，保证每日光照时间12 h。

1.3 试剂 肺炎支原体(ATCC 15531)购自American Type Culture Collection。PPLO：美国BD公司；RNA提取试剂盒：中国Tiangen公司；RPMI-1640：北京索莱宝科技有限公司；Real-Time PCR试剂盒：美国Promega公司；胎牛血清：美国Hyclone公司；引物合成：上海生物工程技术有限公司；免疫组化试剂盒：北京中杉金桥生物技术公司。

1.4 仪器 Line Gene 9600Real-Time PCR仪：中国博日有限公司； M200多功能酶标仪：奥地利TECAN公司；DP72荧光显微镜：日本Olympus奥林巴斯(深圳)工业有限公司。

2 方法

2.1 肺炎支原体培养 肺炎支原体在含有10%酵母浸液的2.1% PPLO并合用20%灭活胎牛血清培养基中进行培养，每隔7 d对培养的支原体进行1次传代培养。

2.2 模型制备及分组给药 50只小鼠称重按相似体质量分组放置，每组抽取体质量相似小鼠1只进行随机分组，直至小鼠分组完成。分为正常组、模型组、阿奇霉素组、枸橼酸喷托维林组、新对叶百部碱组，每组10只。除正常组外，其余各组小鼠滴鼻法感染50 μL106CCU肺炎支原体液，1次/日，连续滴鼻3 d建立MPP模型，造模成功后连续7 d灌胃给药，新对叶百部碱组给药剂量为1.2 mg/(kg·d)；阿奇组给药剂量为32 mg/(kg·d)；枸橼酸喷托维林组给药剂量0.4 mg/(kg·d)(腹腔注射给药)；正常对照组、模型组小鼠予等量纯净水，连续给药1 周。

2.3 观察指标及检测方法

2.3.1 引咳实验 末次给药1 h后，将小鼠置于密闭容器内，0.5 mL氨水浸润棉球放置容器内迅速倒扣防止气体外溢，秒表记数。小鼠出现第1次咳嗽的时长为咳嗽潜伏期，计数在3 min内小鼠咳嗽次数。

2.3.2 肺组织病理观察 引咳实验完成后，脱颈处死小鼠，摘取新鲜完整肺大叶置于10%甲醛溶液中备用(至少24 h)，其余肺组织-80 ℃保存待用。将固定的肺组织取出，清水冲洗除去甲醛残留，石蜡包埋，制成5 μm石蜡组织切片，随后进行HE染色，显微镜下观察。

2.3.3 免疫组化法检测肺组织TRPA1表达 肺组织切片滴加覆盖完全H2O2阻断内源性酶，然后滴加柠檬酸缓冲液抗原修复，按说明书滴加TRPA1(1∶300)比例配制好的孵育一抗，保持4 ℃湿润孵育满8 h，PBS冲洗-反应增强液-二抗-DAB染色-苏木精复染≤1 min-碳酸锂返蓝-水洗-梯度乙醇脱水-二甲苯5 min-封片。200倍镜头下观察TRPA1蛋白的表达量。根据免疫组化IHC评分标准，每组切片选取3个不同视野，根据染色面积范围及着色深浅程度计分，染色深浅程度(0分阴性着色，1分淡黄色，2分浅褐色，3分深褐色)，阳性范围(1分：0～25%，2分：26%～50%，3分：51%～75%，4分：76%～100%)。

2.3.4 Real-Time PCR检测TRPA1 mRNA表达 取小鼠肺组织加入TRIzol试剂提取RNA，经酶标仪检测浓度后，将纯度在1.9～2.0的RNA提取液稀释至100 mg/L。反应液根据PCR试剂盒说明书精准配制。扩增条件为：95 ℃10 min、95 ℃10 s、60 ℃30 s、72 ℃30 s、40 个循环；溶解曲线分析：95 ℃ 10 s、台阶采样、台阶温度设置为0.5 ℃。引物基因序列：TRPA1-forward primers 5′-GCG GTT GGG GAC ATT GCT GAG-3′，TRPA1-Reverse primers 5′-TGG ATA CAC GAT GGT GGA CCT CTG-3′。β-actin forward primer: 5′-CTG GGA CGA CAT GGA GAA AA-3′，β-actin reverse primer: 5′-AAG GAA GGC TGG AAG AGT GC-3′。

2.4 统计学方法 数据用SPSS25.0统计软件进行分析处理，独立样本t检验比较两组间的均数，P<0.05为具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组小鼠引咳实验结果 见表1。

表1 各组小鼠引咳实验结果比较

3.2 各组小鼠肺组织病理变化 模型组出现肺泡

壁充血及肺泡塌陷，支气管上皮脱落，炎性细胞大量浸润。阿奇霉素组肺组织结构相对于模型组有所改善，结构清晰，炎性细胞浸润减少。枸橼酸喷托维林组结构未明显好转，存在炎细胞浸润情况。新对叶百部碱组结构清晰，未见到大量炎性细胞浸润，病变情况有所改善。见图1。

图1 各组小鼠肺组织病理变化(HE，×20)

3.3 各组小鼠肺组织TRPA1蛋白表达免疫组化检测结果 模型组染色面积相对宽泛且着色相对较深。新对叶百部碱组着色较浅，各组计分均低于模型组；阿奇霉素组较模型组着色浅，计分低于模型组。见图2，表2。

图2 各组小鼠肺组织TRPA1蛋白表达的免疫组化检测结果(×200)

表4 各组小鼠肺组织TRPA1蛋白及mRNA表达的比较

3.4 各组小鼠肺组织TRPA1mRNA表达的 Real-Time PCR检测结果 见表2。

4 讨论

百部为百部科植物直立百部[Stemona sessilifolia (Miq.) Miq.]、蔓生百部[Stemona japonica (Bl.) Miq.]或对叶百部(Stemona tuberosa Lour.)的干燥块根[6]，其性味甘、苦，微温，归肺经，具有温润肺气、止咳和杀虫之功效，主要成分为生物碱类、联苯类化合物和对百部醇等，药理作用以抗菌、杀虫、止咳、平喘等为主。在百部的临床应用方面，历代医家已积累了大量的经验，主要用于辨证治疗外感咳嗽、暴嗽、久咳等，多与其他中药配合使用[7]。百部在急(慢)性咳嗽、肺结核、肺炎、 慢性支气管炎等呼吸系统疾病治疗中有较为广泛的应用， 临床疗效亦得到了普遍的认可[8-9]。Chung等[10]比较了对叶百部根的水提物、总生物碱和5种斯替宁碱型(stenine group)生物碱单体的止咳活性，发现在生物碱单体中，新对叶百部碱的止咳活性最强，其强度与同等质量浓度的磷酸可待因相当[11-13]。

本研究通过观察新对叶百部碱对TRPA1的表达的影响探究其镇咳作用，实验结果显示新对叶百部碱能抑制肺炎支原体肺炎小鼠咳嗽的发生发展，减少咳嗽次数及延长咳嗽潜伏期，同时HE结果显示新对叶百部碱可改善支原体肺炎小鼠肺组织结构，并下调TRPA1蛋白表达量及其mRNA的表达量。表示新对叶百部碱对MPP咳嗽具有治疗作用。

综上所述，新对叶百部碱可能通过抑制TRPA1通道蛋白的表达而达到抑制咳嗽效果，为新对叶百部碱的镇咳作用机制提供理论基础和实验根据。