甘草甜素对缺氧复氧损伤心肌细胞的保护作用及其lnc-SNHG5表达的影响

刘东升,唐关敏

(1浙江中医药大学第四临床医学院·浙江 杭州 310053；2嘉兴学院附属第一医院心血管内科·浙江 嘉兴 314000)

急性心肌梗死导致心肌缺血坏死，对人群健康危害极大[1]。在我国心肌梗死的发病率逐年上升[2]。心肌梗死患者及时开放冠状动脉可以减少心肌梗死面积，显著降低死亡率[3]；但缺血心肌恢复血液灌注后易造成心肌结构的损伤，即缺血再灌注(I/R)损伤[4]。在心肌I/R的研究中，研究者发现心肌梗死患者发病后不同时期循环血中lncRNA的水平和心脏左室功能及患者是否存在糖尿病、高血压等并发症密切相关，说明lncRNA参与缺血性心脏病的发生发展过程[5]。甘草甜素(glycyrdaizin，GL)是从甘草中分离提取的三萜类成分，甘草作为中医处方中使用频率最高的中草药之一，性味甘、平，归心、肺、脾、胃经，具有补脾益气、清热解毒、缓急止痛、缓解药物毒性及烈性等作用。本研究在观察甘草甜素对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用同时PCR检测心肌细胞lnc-SNHG5表达，探讨其相关性。

1 实验材料

甘草甜素(纯度99.80%)购自美国Selleck公司。大鼠H9C2心肌细胞：上海中乔新舟生物科技有限公司。DMEM低糖培养基：美国Hyclone公司；CCK8试剂盒：美国Abmole公司；SNHG5 siRNA：苏州GenePharma公司；Lipofecmine 2000和Lipofectamine® RNAiMAX：ThermoFisher公司。LSRFortessa流式细胞仪：美国BD公司；三气培养箱：美国Thermo公司；Multiskan FC酶标仪：美国 Thermo公司。

2 实验方法

2.1 细胞培养及分组 H9C2心肌细胞培养于DMEM低糖培养基，添加10%的胎牛血清，培养于37 ℃、含5%CO2培养箱中。消化对数生长期细胞，传代至培养皿中，培养初始密度为1×105个/mL。实验过程中将细胞分为4组，分别为：①正常对照组(Control)：常规培养，不予药物或转染处理；②模型组(Hypoxia Reoxygenation,HR)：细胞置于37 ℃、充满5%CO2和95%N2的三气培养箱内缺氧培养3 h，然后再转移至正常培养箱内复氧3 h，以构建缺氧/复氧模型； ③转染组(Transfection group，TG)：将sh-SNHG5基因序列克隆到pLKO载体中，构建了SNHG5基因敲除稳定细胞株，sh-SNHG5的引物见表1。④甘草甜素组(Glycyrrhizin group，GP)：于缺氧/复氧前给与甘草甜素，浓度为40 μmol/L，随后予以缺氧/复氧处理。

表1 sh-SNHG5的引物序列

2.2 CCK-8 法检测心肌细胞存活率 按照试剂盒的说明，取对数期生长的细胞消化后制成细胞悬液，铺96孔板，每孔1×105个细胞，分别按照2.1分组进行处理，其中正常对照组单独铺96孔板，其余3组细胞铺设于同一块96孔板，每组设定10个孔，各组处理后测定各组H9C2心肌细胞的活性，每孔微量加样器加100 μL的CCK-8溶液，避光孵育3 h，通过酶标仪测定450 nm波长下的吸光度值，计算细胞存活率。细胞存活率=(本组吸光度值/对照组吸光度值)×100%。

2.3 流式细胞仪检测心肌细胞凋亡 每组细胞按2.1分组处理后分别收集培养上清液，使用1 mL的Bingding Buffer(1×)混悬细胞，300×g离心10 min，弃上清液。使用1 mL的Bingding Buffer重新混悬细胞，调节细胞密度至1×106个/mL。取100 uL每管，每管再加入5 μL膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)。避光常温状态下轻混匀10 min，滴加5 μL碘化丙啶，避光常温下继续反应5 min，滴加PBS 500 μL轻混匀，流式细胞仪检测。细胞凋亡率=(早期凋亡数 + 晚期凋亡数)/总细胞数。测5次，取均值与标准差。

2.4 qPCR 检测心肌细胞lnc-SNHG5表达水平 每组细胞按2.1 分组处理后分别收集细胞，根据Trizol试剂盒的说明提取RNA,根据逆转录试剂盒说明合成CDNA，以CDNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增。扩增条件为：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火 2 min，共40个循环。以β-actin 为内参，采用 2-△△Ct法计算lnc-SNHG5的表达水平，重复3次。

3 结果

3.1 各组心肌细胞存活率比较 以正常对照组细胞为参照，模型组、转染组、甘草甜素组细胞的存活率分别为(16.14±3.95)%、(35.16±5.73)%、(42.59±6.31)%。各组细胞存活率比较，差异有统计学意义(F=18.98，P=0.0025)，且转染组与甘草甜素组细胞存活率均较模型组显著升高(均P<0.05)，而甘草甜素组与转染组细胞存活率的比较也具有统计学意义(P<0.05)。

3.2 各组心肌细胞凋亡率比较 各组细胞凋亡率比较差异均有统计学意义(F=104.7，P<0.0001)。进一步两两比较，与正常对照组相比，模型组细胞凋亡率显著增高(P<0.05)；且甘草甜素组与转染组细胞凋亡率较模型组均明显降低(均P<0.05)，提示甘草甜素或沉默lnc-SNHG5的表达可降低缺氧/复氧损伤细胞凋亡率，对细胞有保护作用，见表2。

表2 各组心肌细胞凋亡率比较

3.3 各组心肌细胞lnc-SNHG5表达水平比较 与正常对照组相比，模型组与甘草甜素组lnc-SNHG5的表达水平均升高(均P<0.05)，转染组lnc-SNHG5的表达水平无改变(P>0.05)，与模型组相比，甘草甜素组lnc-SNHG5的表达水平明显降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组心肌细胞lnc-SNHG5表达水平比较

4 讨论

甘草甜素是中药甘草的主要成分，由1分子甘草次酸与2分子葡萄糖醛酸组成，为水溶性物质[6]。目前研究发现甘草甜素在抗癌、抗病毒、抗氧化、抗炎方面均有作用[7-8]，同时甘草甜素通过抑制HMGB1表达发挥组织器官缺血再灌注损伤保护作用[9]。Tiziana等[10]研究证实甘草甜素通过抑制炎症反应发挥对脊椎再灌注损伤的保护作用。Zhai等[11]通过动物实验证实甘草甜素可通过抑制心肌缺血再灌注后HMGBI的表达，减轻炎症反应，减少心肌缺血再灌注损伤。此外，甘草甜素可以显著减轻大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡损伤程度，并参与调节Bax和细胞色素C的释放，影响caspase-3活性从而减轻心肌细胞凋亡，该保护机制可能与抑制JNK磷酸化有关[12]；然而甘草甜素对于心肌细胞缺氧复氧的相关研究尚未见报道。

心脏疾病的发生与异常的心脏基因调控网络紧密相关，最新的研究证实非编码RNA在多种心脏疾病及众多的疾病中均发挥了相关作用。LncRNA由超过200个核苷酸所组成，是一种新的非编码转录RNA，缺乏完整开放的阅读框，不具备编码蛋白质的功能，其主要通过募集转录因子或参与组蛋白修饰发挥基因表达调控的作用；lncRNA也可通过内源性竞争性RNA和miRNA关联作用，对靶基因进行调控[13-14]。在心肌缺血再灌注损伤的研究中，不同时期外周血HIF-1α与lncRNA表达与患者是否患有高血压、糖尿病及心脏左心室功能均具有紧密联系，说明lncRNA在缺血性心脏病的发生发展中发挥了相关作用[15]。其他相关研究也显示lncRNA与miRNA的结合调控靶基因的表达，对缺血心肌细胞的功能及存活有一定影响[16-17]。

LncRNA在心肌I/R损伤的功能研究刚刚起步，目前关注较多的lncRNA有H19、MALAT1、ARF等，lnc-SNHG5的研究主要在淋巴癌、大肠癌及食管癌等肿瘤领域。LncRNA-SNHG5 (small nucleolar RNA host gene 5)在2000年由Tanaka等在人类B淋巴瘤细胞中发现的，由snoRNA (small nucleolar RNA)家族U50和U50’的宿主基因U50HG 6个外显子组成的成熟剪切体，U50HG定位于染色质基因组断点t(3; 6)(q27; q15)。位于基因组断点位置的基因是候选肿瘤相关基因的重要指标。Zhao L发现lncRNA-SNHG5/miR-32/KLF4轴对胃癌细胞的迁移进行调控[18]。lncRNA-SNHG5通过抑制STAU-1表达促进结直肠癌细胞的存活[19]，其表达异常在乳腺癌细胞MDA-MB-231中得到了验证[20]。但lncRNA-SNHG5在心血管疾病的研究中未见报道。本课题组前期在大鼠心肌I/R模型的lncRNA和mRNA芯片检测中，获得57个差异表达的lncRNA。荧光定量PCR验证发现lnc-SNHG5在I/R模型和心肌细胞H/R模型中均表达升高。其差异性表达提示lncRNA-SNHG5很可能在心肌I/R损伤中发挥重要的调控作用。因此，本课题组重点探索了其与心肌缺血再灌注损伤的相关性。

本研究构建了lnc-SNHG5基因沉默的H9C2心肌细胞模型及甘草甜素处理的缺氧复氧H9C2心肌细胞，实验结果显示甘草甜素及lnc-SNHG5沉默可以保护缺氧复氧心肌细胞，各组lnc-SNHG5表达qPCR检测结果显示模型组lnc-SNHG5表达明显增高，甘草甜素预处理可有效抑制心肌细胞lnc-SNHG5的表达。

综合上述，甘草甜素可能通过抑制lnc-SNHG5的表达发挥对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用，而lnc-SNHG5抑制后的下游通路改变有待进一步研究。