排血对大泷六线鱼的锁鲜增强效应

2022-09-30刘悦朋刘俊荣蔡琰齐琳徐昙烨田元勇曲秦坤

大连海洋大学学报 2022年4期

刘悦朋，刘俊荣，蔡琰，齐琳，徐昙烨，田元勇，曲秦坤

(大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁大连 116023)

中国经济海水鱼类种类繁多，如鲈Lateolabraxjaponicus、褐牙鲆Paralichthysolivaceus、大泷六线鱼Hexagrammosotakii和许氏平鲉Sebastesschlegelii等，主要通过人工养殖和海洋捕捞的形式获得。目前，受环境和人为因素影响，国内海洋鱼类捕捞量逐年减少，人工养殖产量增加[1]，据2021年中国渔业统计年鉴报道，2020年中国海洋捕捞鱼类产量为648.7万t，比2019年减少4.99%，海水养殖鱼类产量为174.9万t，比2019年增长8.97%。受国内水产品养殖和流通特点的限制，渔业产业以小规模和产地流通为主，在中国多形成地方经济鱼种，渔业产业受到限制。此外，水产品销售中以传统的活鱼销售模式分销时，在运输过程中会造成鱼类应激，致使品质恶化，常有“活而不鲜”现象发生。

对鲜活水产品品质的相关研究中，本研究团队提出了品质易逝期锁鲜机制[2-4]，前期针对不同品种的鱼和贝采取的常规锁鲜处置均侧重于速杀后即刻冷却的处理方式，这种方式呈显著的锁鲜效果，但未考虑排血对锁鲜效果的影响。衣鸿莉等[5]对离水后的养殖大菱鲆断髓速杀后发现，冰藏仍具有较高的品质。冷寒冰等[3]研究发现，在品质易逝期对红鳍东方鲀进行锁鲜处置，可以延缓细胞的瓦解，并对后易逝期有延迟效应。周进等[6]、赵前等[7]通过对褐牙鲆及许氏平鲉的研究发现，在品质易逝期通过破髓处置可以最大限度地接近品质上限，延缓品质下降。此外，除了生化及肌肉质地等指标外，将白度作为评价鱼品品质的指标也很重要。排血处理对于鱼肉白度起着关键的作用，零排血和排血不充分的鱼会导致鱼片变色，影响感官评价。Olsen等[8]对鳕致死后不同时间点进行排血发现，排血处理较晚的鳕鱼片颜色发生明显的改变，降低了产品品质。综上，基于前期的锁鲜处置，源头锁鲜机制还有较大的探索空间。

大泷六线鱼Hexagrammosotakii，又名六线鱼，主要分布于中国黄海、渤海沿岸海域，以及朝鲜和俄罗斯等近海海域，该鱼为冷温性海洋鱼类，栖息在沿岸或者礁石附近海域，属中上层鱼类[9]。大泷六线鱼肉质鲜美，具有较高的经济价值，在中国北方已经成为重要的养殖鱼类之一[10]，享有 “北方石斑鱼”美誉[11]。本研究中，以大泷六线鱼为研究对象，聚焦大泷六线鱼排血效果对锁鲜的增强效应，通过对其在品质易逝期进行常温和冰水排血处理，探讨不同温度下排血对后易逝期鱼品质的影响，以期对源头锁鲜方法做出进一步改善。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用活体养殖大泷六线鱼于2021年5月购自大连市长海县某养殖场(养殖海水盐度为30～32，温度为10 ℃)，共66尾,体质量为300～400 g的健康活体，以6尾/袋充氧有水包装，运输2 h抵达大连海洋大学食品挤压实验室。

主要试剂：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾购自国药集团化学试剂有限公司；KOH、NaOH和葡萄糖购自天津市科密欧化学试剂有限公司；碘乙酸钠购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

仪器设备：GL-21M 高速冷冻离心机(德国 HERMLE La-bortechnik GmbH 公司)；Synergy H1 酶标仪(美国柏腾公司)；HG-200高速分散均质机(日本 HSIA-NGTAI)；UV-1800PC 紫外-可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；PB-10 pH计(德国 Sartorius 公司)；Agilent 1260高效液相色谱仪(美国 Agilent 公司)；JEM-1200EX透射电子显微镜(日本电子公司)。

1.2 方法

1.2.1 原料处理

缓冲恢复：将活鱼运抵实验室后立即采样3尾，记为原料初始点(live raw，LR)，其余63尾置于人工海水中暂养以消除活体应激。

排血处置：暂养1 h后，逐条捞出48尾，通过切断脊髓和尾鳍速杀后，分别置于盛有240 L的常温水或冰水(冰和水质量比为1∶1)中(各24尾)排血10 min，期间施加人工搅动，分别记为增强锁鲜组(well-bled，WB)和常规锁鲜组(poor-bled，PB)；排血后立即捞出放入冰水中进行锁鲜处置2 h。其余15尾活鱼不做任何处理，记为窒息对照组(none-bled，NB)。

冷藏处置：冰藏品，随机从2个锁鲜组各取3尾鱼以单体塑料袋封装后置于泡沫箱中，覆冰后移入4 ℃层析柜冷藏48 h，用于大泷六线鱼死后僵直进程观察；冷鲜品，将3个处理组剩余的大泷六线鱼逐条用密封袋包装后置于泡沫箱中，放入4 ℃层析柜中冷藏96 h，用于冷藏稳定性观察分析。

采样方案：运抵实验室后立即采样为原料初始点，暂养1 h后在不同的排血温度下排血10 min时和冰水锁鲜2 h时分别进行采样，其余分别在冷藏12、24、48、72、96 h时进行采样，每个采样点采集3尾大泷六线鱼作为平行。在取样前对每尾鱼先进行僵直拍照测量，然后剖片，选取背部肌肉用于显微结构分析。其余肌肉组织用于生化指标分析。所有样品经液氮速冻后置于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。

1.2.2 生化指标分析

pH测定：参照刘金洋等[12]的方法。取2 g背部肌肉，加入10 mL碘乙酸钠，在冰浴中以3 000g进行均质，共进行2次，每次30 s，冰浴中静置20 min，采用pH计测定pH值，每组设置3个平行。

糖原含量测定：参照刘慧慧等[2]的方法并做出调整。取2 g肉糜加入4 mL体积分数为30%的KOH，置于100 ℃的沸水中煮沸20 min，取出后流水冷却至室温，加入20 mL无水乙醇静置20 min后，经5 000g离心10 min，弃上清液，在沉淀中加入10 mL蒸馏水，使沉淀充分溶解；加入一滴饱和KCl，再加入15 mL的无水乙醇，再经5 000g离心10 min后，弃上清液，在沉淀中加入少量蒸馏水，充分搅拌至完全溶解，定容至25 mL；取100 μL上清液加入400 μL显色液，充分摇匀后置于沸水浴中煮沸10 min，取出并经流水冷却后静置10 min；取200 μL置于96孔酶标板上，在620 nm下测量吸光度，每个样品设置3组平行。

ATP及其关联物含量测定：参照刘慧慧等[2]的方法。取背部肌肉2 g，加入10 mL体积分数为5%的PCA，在冰浴中用玻璃棒捣碎10 min，加入2 mol/L的NaOH调pH至2.0～3.5，加水定容至20 mL，经5 000g离心5 min，取4 mL上清液过孔径0.45 μm的膜，加入1 mL 0.1 mol/L的磷酸盐缓冲溶液( pH 7.5)，摇匀后置于-40 ℃冰箱中保存，用反相高效液相色谱测定。

1.2.3 物理指标分析

鱼体僵直：参照Tulli等[13]的方法。将鱼放置操作台上，先测量鱼体总长，找出鱼体中间的位置，将鱼体前半部分置于水平操作台上，其余部分自由落下，用手指轻轻按住鱼头部，测量尾部与水平板构成的最初下降距离B(cm)，以及每个采样点测定的鱼尾部与水平板构成的垂直距离C(cm)，计算僵直指数A(%)，计算公式为

A=(B-C)/B×100%。

外观观察：结合肉眼观察，并采用商品折叠式样品摄影棚拍摄[14]。将去除头部和内脏的大泷六线鱼置于摄影棚内，用手指拨开腹部肌肉，使得腹腔向上，用相机对腹腔进行拍照以测定白度。拍取腹部照片后，将其进行剖片，并置于水平桌面上进行鱼片白度拍照及测定。

肌肉显微结构：参考 Ando等[15]的方法。取相同背部肌肉，修整为1 cm ×1 cm×2 cm 的肌肉块，用体积分数为4%的多聚甲醛固定24 h。将制成的切片进行伊红(H.E)染色，在100倍光学显微镜下观察并拍照。

断裂强度：参照Misima等[16]的方法。选取同一位置背部肌肉，修整为1 cm×1 cm×2 cm的肌肉块，用质构仪测定1 000 N剪切力下鱼肉的断裂强度，每组设置3个平行。

排血效果：将鱼从暂养水箱内捞出后立即移入电子秤上装有水的泡沫箱中，测定其体质量后立即捞出，经断髓速杀后分别置于常温水排血箱和冰水排血箱中，各21尾，10 min后捞出，测定宰杀后鱼的质量，宰杀前后鱼的质量差即为排血量。

1.3 数据处理

试验数据经过Excel 2010软件处理，试验结果以平均值±标准差(mean±S.D.)表示。采用SPSS 25软件对试验结果进行单因素方差分析，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 大泷六线鱼死后僵直进程特性

称量2个锁鲜组各21尾大泷六线鱼宰杀前后质量差，结果表明，常温排血的增强锁鲜(WB)组鱼的平均排血量显著高于冰水排血的常规锁鲜(PB)组(P<0.05)，二者排血量分别为(8.6±3.1)、(5.7±2.3)g/ind.。

增强排血对冰藏条件下大泷六线鱼死后僵直进程的各个阶段具有显著的延长效果(图1)。增强排血的WB组在覆冰贮藏15 h时僵直指数达到最大，而PB组在覆冰贮藏12 h时僵直指数达到最大，且PB组的解僵时间早于WB组，在覆冰贮藏48 h时发现，PB组可发生完全解僵，而此时WB组僵直指数为12.5%(图2)。

A为原料初始点；B～E分别为WB 11 h、WB 15 h、WB 33 h、WB 48 h；F～I分别为PB 11 h、PB 15 h、PB 33 h、PB 48 h。A，the live raw; B-E，WB 11 h, WB 15 h, WB 33 h, and WB 48 h; F-I， PB 11 h, PB 15 h, PB 33 h, and PB 48 h.图1 不同排血效果下冰藏大泷六线鱼僵直状态对比Fig.1 Comparison of the rigor mortis in iced rock greenling Hexagrammos otakii in poor-bled and well-bled groups

图2 排血效果对冰藏大泷六线鱼僵直指数的影响Fig.2 Effects of bleeding treatment on rigor index in iced rock greenling Hexagrammos otakii

2.2 大泷六线鱼死后生化代谢特性

2.2.1 排血对肌肉ATP降解的影响采自大连市长海县养殖的大泷六线鱼运抵实验室后，随机选取3尾作为原料初始点，测得其体内ATP含量为1.72 μmol/g，其余试验鱼用人工海水暂养1 h，暂养后鱼体内ATP含量明显恢复，可达4.32 μmol/g，可见大泷六线鱼经过运输后暂养可恢复体内能量代谢平衡。

从图3可见：增强排血对鱼死后ATP的降解速率有显著性影响(P<0.05)；增强排血处置的WB组冷鲜鱼在贮藏12 h时，体内ATP含量较排血10 min时明显下降，且WB组ATP含量明显高于PB组，二者分别为1.20、0.58 μmol/g，NB组在贮藏12 h时ATP含量为0.15 μmol/g；随着贮藏时间的延长，IMP含量呈先下降后上升再下降趋势，各组IMP均在24 h达到最大值；整个贮藏期间，未检测到HxR含量。

图3 排血效果对冷藏鱼肌肉ATP分解代谢的影响Fig.3 Effects of bleeding on catabolism of ATP-related compounds in fish muscle during chilling storage

2.2.2 排血对肌肉糖原降解的影响从图4可见：增强排血对肌肉糖原含量变化有一定影响，糖原也是动物体内的能量物质，在人工海水中暂养1 h后，鱼肌肉糖原含量有明显恢复；随着冷藏时间的延长，糖原含量逐渐减少，在冷藏48 h时趋于稳定并达到最低值；整个冷藏期间，WB和PB组无明显差异(P>0.05)，二者略高于NB组，仅在12 h时WB组显著高于NB组(P<0.05)。

标有不同字母者表示同一时间下不同组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母或无字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)，下同。The means with different letters at same time are significant differences in different groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter or no letter are not significant differences, et sequentia.图4 排血效果对冷藏鱼肌肉糖原含量的影响Fig.4 Effects of bleeding on glycogen content in fish muscle during chilling storage

2.3 大泷六线鱼冷鲜品的品质稳定性

2.3.1 排血对感官品质的影响通过对不同排血效果下的大泷六线鱼腹腔进行拍照可见，随着贮藏时间的延长，鱼肉白度值逐渐下降，在贮藏24 h时，WB组白度明显高于PB组，而NB组腹腔肌肉内有明显的血液残留，在整个冷藏期间，增强排血的WB组鱼肉白度具有更好的优越性(图5)。这表明，增强排血对鱼肉的感官品质影响较大，增强锁鲜具有更好的感官特性。

2.3.2 排血对肌肉显微结构的影响在100倍光学显微镜下观察发现：在原料初始点，鱼肉肌肉内细胞紧凑，细胞具有完整的结构；随着贮藏时间延长，鱼肌肉细胞间隙逐渐增大，这是由于在冷藏过程中，连接肌细胞的结缔组织物理强度逐渐下降，导致细胞间隙逐渐增大；鱼死后24 h时，PB组细胞间隙明显大于WB组，NB细胞间隙又较PB组略大，随着贮藏时间延长，贮藏96 h时NB组细胞间隙最大(图6)。这表明，增强排血对鱼肌肉结构影响明显。

A—原料初始点; B—WB 12 h; C—PB 12 h; D—NB 12 h; E—WB 24 h; F—PB 24 h; G—NB 24 h；H—WB 96 h; I—PB 96 h; J—NB 96 h。A—live raw; B—WB 12 h; C—PB 12 h; D—NB 12 h; E—WB 24 h; F—PB 24 h; G—NB 24 h；H—WB 96 h; I—PB 96 h; J—NB 96 h.图5 排血效果对冷藏大泷六线鱼腹部白度的影响Fig.5 Effects of bleeding on belly whiteness of rock greenling Hexagrammos otakii during chilling storage

A—原料初始点; B—WB 24 h; C—PB 24 h; D—NB 24 h; E—WB 96 h; F—PB 96 h; G—NB 96 h。A—live raw; B—WB 24 h; C—PB 24 h; D—NB 24 h; E—WB 96 h; F—PB 96 h; G—NB 96 h.图6 排血效果对冷藏鱼肌肉显微结构的影响Fig.6 Effects of bleeding on muscle microstructure of fish during chilling storage

2.3.3 排血对肌肉质地的影响鱼类在死后其肉质表现出有较强的弹性，但在鱼死后贮藏阶段，其肌肉会发生软化导致其品质下降。在4 ℃下贮藏的大泷六线鱼肌肉断裂强度在12 h时发生明显下降，贮藏48 h时，WB组鱼肌肉断裂强度显著高于PB和NB组(P<0.05)，其余时间点，3组鱼肌纤维断裂强度无明显差异(P>0.05)(图7)。这表明，增强排血对冷藏鱼肌肉质地有一定影响。

图7 排血效果对冷藏鱼肌肉剪切力的影响Fig.7 Effects of bleeding on muscle shearing strength of fish during chilling storage

3 讨论

3.1 鱼体应激水平及其能量恢复

死前应激与死后代谢密切相关，直接影响鱼品品质。原料生产方式是死前应激不可忽视的因素，天然捕捞与人工养殖面临的离水应激水平截然不同，天然捕捞多采用拖网式捕捞，大量的渔获物在网底形成堆积，造成鱼体应激，鱼类应对应激主要表现为全力游泳[17]，其体内的能量物质也发生变化，如体内ATP和糖原含量减少，皮质醇含量增加等，最终导致僵直进程加快等。1950年，Selye最早提出对应激进行等级分类，分别为初级应激、二级应激和三级应激[8]。初级应激是指在捕捞和运输过程中产生应激源，是一种神经和内分泌应激，脑部神经感应到应激源，通过神经传导给背部中枢神经和脑垂体，分泌儿茶酚和皮质醇等；二级应激是指在捕捞过程中由于应激造成的鱼体内能量代谢、渗透压变化和免疫系统调节反应等过程；三级应激是指造成鱼体疾病和行为方式的改变，对鱼是一种长期的不可逆危害。初级应激和二级应激产生的应激激素和能量消耗，均可在后期恢复中重新达到体内平衡，由于鱼的品种差异，恢复的体内平衡时间不同。本试验中，通过厢式货车对鱼有氧有水运输2 h，运抵实验室后进行人工海水暂养1 h处置，通过分析ATP及其关联化合物含量的变化发现，未经暂养处置的原料初始点活体ATP含量为1.72 μmol/g，糖原含量为0.98 mg/g，通过人工海水暂养1 h后，活体ATP含量得到明显的恢复，为4.32 μmol/g，而鱼体的糖原含量也得到明显的恢复，WB组恢复到1.24 mg/g，PB组恢复到1.14 mg/g。这与Fantini[18]对南美鸭嘴鲇Pseudoplatystomaspp.静息时间恢复体内能量代谢平衡的研究结果一致。证实在运输过程中产生的初级应激和二级应激可以得到恢复。这表明，排血效果对大泷六线鱼死后代谢影响显著，适宜的应激恢复和排血对大泷六线鱼品质有较好的改善。

3.2 鱼死后的僵直进程与代谢

鱼类僵直的发生受多种因素的影响，宰前应激、致死方式和贮藏条件等都会影响其僵直的进程。鱼死后肌肉ATP发生快速降解，糖原也逐渐被消耗，肌动蛋白和肌球蛋白相结合形成肌动球蛋白复合体使僵直发生。如比较破髓和断髓处置对养殖褐牙鲆僵直的影响时发现，通过破髓处置的褐牙鲆僵直发生在48～72 h，而断髓处置组的僵直发生在24～48 h[6]。虽然破髓处置对鱼类僵直进程有延缓作用，但破髓处置需要专业受训人员精准操作，故难以实现工厂化生产。本试验中，采用断髓处置，通过观察2个锁鲜处理组冰藏品的僵直进程发现，增强锁鲜的WB组冰藏15 h时达到最大僵直，在冰藏30 h后开始缓慢解僵，而常规锁鲜的PB组则在冰藏11 h时达到最大僵直，在冰藏29 h时开始解僵，这表明通过增加常温水增强锁鲜，对僵直和解僵的进程具有显著延缓作用，对品质具有一定的改善作用。

鱼体速杀致死后，其肌肉ATP在各种酶的作用下被逐步分解至ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx。影响活体原料及死后鱼体肌肉中ATP含量的因素十分复杂多变[19]，其中，影响鱼类肌肉中ATP降解速率的主要因素之一是5′-核苷酸酶的活性[20]。有研究发现，热带鱼的鲜度品质与IMP的分解速度有关，而不是由细菌的数量决定[21]。随着ATP被逐步降解和降解物的增加，鱼的鲜度逐渐下降。本试验中，经过不同的排血条件处置后发现，WB组对于ATP有较好的保留，在冷藏贮藏12 h后发现仍还含有1.20 μmol/g的ATP，而PB组ATP含量仅为 0.58 μmol/g。这表明，有效的排血方式对鱼贮藏品质有一定影响。

3.3 排血效果对品质的重要性

鱼体内血液循环是单循环系统，先由腹动脉泵出后经鳃流入背动脉，经毛细血管运至全身各器官及细胞，后经毛细血管汇聚至背静脉流入心脏完成循环[17]。排血对鱼肉品质有着至关重要的影响，尤其是对于白肉鱼，为了减少鱼体内残余血对于肉质感官及品质的影响，一些国家建议先将鱼进行15～20 min排血处置后，取出其内脏，在冻藏过程中鱼肉品质具有良好的改善。早在1995年，Huss等[22]对鱼的排血效果研究发现，切断背动脉和喉咙有最好的排血效果，并发现在捕捞船上进行排血和去除内脏比通过运输后进行排血效果更好，且发现在进行排血时，鲜活的鱼排血效果最好，其次是在僵直前进行排血，可通过僵直使肌肉收缩从而使血液流出。Olsen等[8]对野生大西洋鳕进行直接排血和去内脏后再排血的比较，发现先去内脏再排血有更好的排血效果。本试验中，通过切断脊髓和尾鳍后进行排血，排血效果也较好。但排血效果对于鱼片感官特性的影响不是影响肉质的唯一因素，如在捕捞过程中的挤压，以及船或甲板上由于操作不当造成的损伤等均会影响其鱼片品质。同时，鱼片感官也不是作为肉质评价的唯一指标，如Alias等[23]通过鱼鲜度探测器(FFD)测定鱼眼的红度值(RV)来进行品质评价。

本研究中，通过脑后切断脊髓和喉咙快速致死，并且切断尾部脊髓，在常温水箱和冰水水箱中对大泷六线鱼进行人工蠕动鱼体模拟活鱼游泳排血处置，通过鱼体蠕动可以促进体内血液排出。鱼体内含血量占体质量的1.5%～3.0%，通过不同的排血温度处置后，WB组排血效果最好，近乎排出体内全部血量。在后期冷藏过程中对外观品质观察发现，在4 ℃下冷藏12 h时，WB组腹腔白度表现出明显的亮度，PB组腹腔略表现出微红色，NB组腹腔表现出最低的白度值；在贮藏96 h时，WB组与PB组相比仍保持很好的白度，在整个贮藏期间NB组腹腔均有明显积血，表现为较低的感官白度值。此外，腹腔血对鲜度品质及其稳定性均有影响，今后需增加清洗处置以进一步提高增强锁鲜效应。

本研究中，为了更好地了解增加排血条件对锁鲜效果的增强效应，对冷鲜大泷六线鱼研究发现,增强锁鲜的WB组肌肉细胞排列整齐，细胞间隙明显小于常规锁鲜PB组。可见，增强排血对大泷六线鱼的外观和肌肉品质具有明显的改善。

3.4 鱼肉鲜度品质的内涵

鱼类离水后于空气中经剧烈挣扎后窒息而死，严重影响鱼品的品质。目前，有关水产品品质已突破传统鲜度的范畴，结合产业的生产模式，由于原料的可追溯性，基于海洋捕捞的传统鲜度评价不再适用于现代水产养殖行业，内涵亟待提升。赵前等[24]就水产品的现状及鲜度评价做出进一步阐述，表明传统的鲜度评价对现代水产品养殖企业的局限性和不适用性，指出针对现代渔业发展模式的品质评价方法亟待改善。传统的渔业运输消费模式使鱼在运输中造成强烈的应激，并造成品质的下降，导致“活而不鲜”的现象出现。本研究团队多年来基于动物福利角度，从品质易逝期入手，通过在品质易逝期进行速杀和锁鲜等处置发现，在贮藏过程中保持良好的品质，对现代渔业养殖模式的发展具有一定的理论指导意义。