建立一种动物源性食品中沙丁胺醇的液相色谱-串联质谱法检测方法

叶夏声，邱永为，黄 婷，李湘媛

(1.深圳市质量安全检验检测研究院，广东 深圳 518000；2.广东省市场监督管理局食用农产品监管重点实验室，广东 深圳 518000)

沙丁胺醇(salbutamol，SAL)是人工合成的肾上腺素β2 受体兴奋药之一，属水杨醇类的肾上腺素激动药[1]，临床上常被用于治疗哮喘。沙丁胺醇对动物骨骼肌(瘦肉)的生长具有促进作用，具有能够有效减少脂肪含量、提高摄入食物的转化率、增大经济效益等作用，故常被黑心商家作为饲料添加剂用于畜禽的饲养中[2]。中国、欧盟等许多国家或地区的管理部门都禁止将沙丁胺醇在畜禽生产中使用，而实际生产中依旧存在违法使用的情况[3]。当消费者摄入含有沙丁胺醇的肉制品时，由于机体对丁胺醇的代谢较慢，导致其在心脏和肝肾中积累，进而引发各种不良的生理反应，如心悸、头晕、烦闷、肌肉颤抖、失眠等；严重时还会诱发和加重糖尿病、心血管疾病[4]。2009 年10 月29 日，欧洲药品管理局发出警告，认为沙丁胺醇在治疗有严重心脏疾病患者的呼吸道疾病时存在引发心肌缺血的风险，可能会出现心脏病恶化的症状，并且不适用于患有缺血性心脏病或有明显缺血性心脏病风险因素的女性患者[5]。对于糖尿病患者，沙丁胺醇能增加肌糖原的分解，引起血乳酸和丙酮酸水平的升高，酮体含量增多，从而导致代谢紊乱，出现酮症酸中毒和乳酸中毒[6]。资料显示，沙丁胺醇还可能会导致摄入者出现低血钾症和生殖内分泌毒性[7]。荷兰药物警戒中心收录报告显示沙丁胺醇可引起儿童龋齿[8]。

目前，常用的沙丁胺醇检测方法有高效液相法、酶联免疫法、气质联用法、液相色谱-串联质谱法等。前三种方法存在灵敏度较低、前处理步骤复杂、极容易出现假阳性和定性结果的准确性较差等问题。相比之下，液相色谱-串联质谱法具有高效的分离能力和准确的定性定量能力，因此被广泛使用[9]。高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)-串联质谱(gas chromatography-mass spectrometer，MS/MS)是目前分析SAL 最有效的方法之一。一方面HPLC 法可分离一些热不稳定的小分子极性物质，无需衍生化步骤；另一方面质谱对化合物的定性能力，特别是二级质谱多反应离子检测(multiple reaction monitoring，MRM)的定性能力超强[10]。在国家相关检测标准中，对动物源性食品中β-受体激动剂的检测标准主要有农业农村部1025 号公-18-2008《动物源性食品中β-受体激动剂残留检测液相色谱-串联质谱法》、GB/T21313《动物源性食品中β-受体激动剂残留检测方法液相色谱-质谱/ 质谱法》、GB/T22286《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定 液相色谱串联质谱法》[11-13]等。本研究旨在针对动物源性食品中沙丁胺醇，对上述涉及的标准进行一定的优化整合，缩减前处理步骤，使用液质联用仪来对物质进行定性定量检测，提高检测工作效率，为动物源性食品中沙丁胺醇的检测提供有力的技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

安捷伦1290 液相色谱仪、AB Science 质谱仪、恒温水浴摇床、氮吹仪、漩涡混合仪、电子天平、旋涡混合器、冷冻离心机、超纯水仪、超声波清洗机、混合阳性离子(mixed-mode cation exchanger，MCX)固相萃取柱(规格：60 mg，3 cc)均从相关生产厂家采购。

1.1.2 药品与试剂

0.2 mol/L 乙酸铵(pH=5.2)；0.1 mol/L高氯酸溶液；5%氨化甲醇；甲醇(色谱纯)、甲酸(色谱纯)；乙酸(分析纯)；氢氧化钠(分析纯)；β-葡萄糖醛苷酸酶/ 芳基硫酸酯酶(20 U/mL)；复溶液：甲醇/ 水/ 甲酸(10∶90∶0.09，v/v/v)。

1.2 样品准备

取适量新鲜牛肉组织，充分绞碎且均质，于-20 ℃避光保存。

1.3 标液的配制

准确称取沙丁胺醇的标准品，用甲醇分别配成100 μg/mL 的标准储备液，-18 ℃冰箱中保存，有效期6 个月；再分别移取适量的沙丁胺醇标准储备液，用甲醇逐级稀释成适当浓度的沙丁胺醇标准工作液。

1.4 样品前处理

准确称取试样2.00 g(±0.01 g)，置于50 mL 离心管中，加入8 mL 乙酸铵溶液(0.2 moL/L)(pH=5.2) 和 40 µL 20 U/mL β-葡萄糖醛苷酸酶/ 芳基硫酸酯酶，加盖1 900 r/min 涡旋振荡5 min，37 ℃恒温摇床避光酶解12 h。酶解后放置至室温，在酶解液中加入300 µL 高氯酸(将pH 调至1.00)，涡旋30 s，10 000 r/min 低温离心5 min，移上清液置于另一50 mL离心管中。在残渣中加入2 mL 高氯酸溶液(0.1 moL/L)，涡旋30 s，10 000 r/min低温离心5 min，合并上清液。上清液中加入570 μL 氢氧化钠溶液(5.0 moL/L)(将pH 调至4.00)，备用。

MCX 固相萃取柱分别依次用3 mL 甲醇、3 mL 水活化。取备用液全部过柱，再依次用3 mL 水、3 mL 甲醇淋洗小柱，抽干。用5 mL 5%氨化甲醇洗脱，收集至15 mL 塑料离心管。洗脱液在40 ℃下氮吹干，用甲醇+水+甲酸(10+90+0.09) 溶液定容至1 mL，震荡5 min，过0.22 μm 滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线

按照农业农村部1025 号公告-18-2008标准条件设置仪器参数，配制一系列浓度的标准样品溶液(0.25 µg/kg、0.5 µg/kg、1.00 µg/kg、2.50 µg/kg、5.00 µg/kg)，待仪器参数稳定后，对系列标准样品溶液进行测定，绘制标准曲线，沙丁胺醇相关系数为R2=0.999 83。

2.2 方法检出限确定

以空白牛肉样品为基质，设置一个阳性样品，浓度为C(0.25 μg/kg)，按照操作进行前处理，之后上机，测得沙丁胺醇信噪比分别为S/N=10.9，可计算检出限(method detection limit，MDL)为0.068 8 µg/kg。计算公式 如下：

检出限(MDL)(μg/kg)=3C/(S/N)

2.3 回收率及精密度确定

使用空白牛肉的样品作为基质条件，测定加标回收率，加标浓度分别为0.25 µg/kg、0.50 µg/kg、2.50 µg/kg。将加标样品和空白样品通过前处理后进行上机测试，结果见表1 所示。根据表1 与表2 中相对标准偏差和回收率结果可发现，该方法的相对标准偏差较低，且回收率表现较好，沙丁胺醇的回收率范围为92.0%～102.0%，相对标准偏差为1.1%～4.6%。该方法的检出限较低、重复性较好，能保持较为优异的回收率，可用于沙丁胺醇的定性、定量检测。

3 结论

经过上述实验验证，沙丁胺醇一系列浓度的标准样品溶液(0.25 μg/kg、0.50 μg/kg、1.00 μg/kg、2.50 μg/kg、5.00 μg/kg) 的标准工作曲线相关系数为R2=0.999 83，实验结果满足标准方法的要求。经测定，沙丁胺醇的方法检出限为0.068 8 μg/kg，符合标准方法的要求。加标回收试验中加标浓度分别为0.25 μg/kg、0.50 μg/kg、2.50 μg/kg，经测定，沙丁胺醇的相对标准偏差为3.2%、4.6%和1.1%，加标试验回收率范围为92.0%～102.0%，均符合方法要求，验证结果满足农业农村部1025 号公告-18-2008《动物源性食品中β-受体激动剂残留检测液相色谱-串联质谱法》的要求，具有较好的精密度和准确度，同时该方法具有前处理相对简单、溶剂的使用量较少、净化效率高和待测组分损失小等特点，适合动物源性食品中β-受体激动剂的定性及定量测定。