连梅汤对糖尿病模型小鼠血糖和肠道菌群的影响＊

姜广坤，牛雯颖，张文娓，冯月男，刘 鑫，王晓源，丁 莹

（1. 贵州中医药大学基础医学院 贵阳 550025；2. 黑龙江中医药大学实验实训中心 哈尔滨 150040；3. 黑龙江护理高等专科学校医学基础系药理教研室 哈尔滨 150040）

1 引言

在全球范围内，糖尿病已成为危害人们健康的严重挑战。多尿、多饮等症状被视为糖尿病的重要病态表现[1-2]。根据《中国2 型糖尿病防治指南》2017 版结果显示[3]，2 型糖尿病（T2DM）占糖尿病患者总数的90%以上，我国18 岁以上成人T2DM 发病率已达10.4%，男性11.1%，女性9.6%，60 岁以上的老年人罹患糖尿病的人数均在20%以上。因此，研究T2DM 的病理机制及防治的有效方法具有重要的意义和紧迫性。

在我国传统中医学领域，将糖尿病归属于“消渴病”症，随着中医理论的不断完善和临证的日趋深入，阴虚与燥热被认为是消渴病（糖尿病）的主要发病机制，两者相互影响，互为因果[4]。中医常以益气养阴、清热化瘀论治疗糖尿病。连梅汤组方出处为《温病条辨》卷三[5]，以黄连、乌梅（无核）、麦冬、生地、阿胶煎煮服用，具有清心泻火、滋肾养液之功效。主治暑邪深入少阴、火灼阴伤、消渴引饮、暑邪深入厥阴、筋脉失养、手足麻痹等症状。研究表明，连梅汤可以从蛋白和基因水平通过MCP-1、SREBP-1c 及FAS 干预2 型糖尿病大鼠脂肪组织微炎症反应，同时也对糖尿病周围神经病变具有一定治疗作用[6]。胰岛素抵抗是2 型糖尿病的重要特征[7]，深入分析中医药治疗二型糖尿病胰岛素抵抗的用药规律，可为中医临床治疗和新药开发提供参考。同时，连梅汤在db/db自发2型糖尿小鼠中的治疗作用还未见报道。

肠道菌群是指微生物在体内长期停留在肠道内，其组成和丰度可影响多种生理过程[8]。近年来，肠道微生物组成和含量的变化被认为是影响许多疾病进展的重要原因，如坏死性结肠炎和糖尿病等[9-10]。糖尿病是一种受人体代谢状态影响的疾病，受到肠道菌群组成的影响[11]。肠道菌群可以进一步影响体内其他重要指标的变化，从而促进疾病的进展。且连梅汤对db/db 小鼠肠道微生物的影响也未见报道。因此，本研究首次通过db/db 糖尿病小鼠，测定血糖和血脂的水平，以及肝脏功能相关指标。并通过分析实验小鼠肠道菌群的变化，验证连梅汤的治疗效果及对肠道菌群的影响。

1 研究思路与方法

连梅汤按照低、中、高三个剂量连续灌胃小鼠14天，收集小鼠血液，肝组织和粪便，利用血生化途径和HE 染色分别检测小鼠血糖、肝功能指标和组织病理改变，最后通过高通量测序获得小鼠肠道菌群组成和多样性分布（图1）。通过上述方法验证连梅汤具有降糖、降脂和保肝的作用，并对肠道菌群具有一定调节能力。

图1 连梅汤治疗糖尿病小鼠流程图。

2 研究与分析

2.1 实验材料

2.1.1 仪器与设备

血糖仪（鱼跃，580 型），江苏鱼跃医疗设备有限公司；高速离心机（凯达，KH19A），湖南凯达科学仪器有限公司；半自动血生化分析仪（普朗，PUS-2018G），北京普朗新技术有限公司；分析电子天平（FA2004N），上海菁海仪器有限公司；制片染色一体机（奥华，KCT-10），孝感奥华医疗科技有限公司；荧光显微镜（汇光，RX50），江苏汇光科技；无菌操作台（SW-CJ-1FD），上海苏净实业有限公司。连梅汤药材黄连、乌梅（无核）、麦冬、生地、阿胶购买于贵州中医药大学第一附属医院中药房。血糖试纸购买于鱼跃（Yuwell）。苏木精-尹红染料购买于上海翊圣生物科技有限公司。粪便DNA试剂盒（D4015-02，Omega，Inc.，USA）。

2.1.2 试剂的制备

组成连梅汤的药味和量分别为黄连6 g、乌梅9 g、麦冬9 g、生地9 g、阿胶6 g。将上述药味合并在1 L 水中浸泡2 h 后开始煎煮，每副药煎煮两次，每次留取300 mL，合并浓缩至39 mL 体积，配制成浓度为1 g·mL-1母液（高剂量组）。使用无菌水对母液进行稀释，配制为0.5 g·mL-1的中剂量组药液和0.25 g·mL-1的低剂量组药液。盐酸二甲双胍片0.25 g/片，取3 片溶于30 mL蒸馏水中，配成0.025 g·mL-1的盐酸二甲双胍水溶液。

2.2 动物实验

2.2.1 动物分组及处理

C57BL/6J 和db/db 小鼠购买于达硕动物中心实验，生产许可证号为SYXK（川）2015-030；使用许可证号为SYXK（川）2014-189。本实验全部动物适应性喂养7 天，C57BL/6J 小鼠作为空白对照，db/db 模型小鼠30只，随机分为5组，分别为对照组，二甲双胍对照组，连梅汤高、中、低三个剂量治疗组，每组6只。空白组、对照组按体重灌胃蒸馏水（10 mL·kg-1），对照组灌胃盐酸二甲双胍水溶液0.25 g·kg-1，连梅汤高、中、低剂量组给药浓度分别为10、5、2.5 g·kg-1，连续给药14天。

2.2.2 样品采集

实验小鼠连续给药14 天后禁食12 h，每组随机选三只小鼠收集粪便并于液氮中储存。当完成实验时，处死小鼠，收集小鼠血液进行血生化检测和测量空腹血糖，收集肝脏组织HE染色实验。

2.2.3 血生化检测

采集小鼠静脉血，在37℃条件下静置30 min，高速离心（3000 r·min-1），离心5 min，收集血清，半自动血生化分析仪检测肝功能相关指标。

2.2.4 微生物DNA提取测序及数据分析

总DNA 按照试剂盒说明书在离心柱上洗脱，-80℃保存，样本在中国浙江省杭州市LC-BIO 技术（杭州）有限公司的PCR 中进行测定。空白样本由未使用的棉签组成，经过DNA 提取处理，测试不含DNA 扩增子。对DNA 扩增的16SV3-V4 区域进行PCR，底物序列：前向底物为5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，反向底物3′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-5′。样品在Illumina MiSeq 平台上测序，配对的reads 按照样品唯一的条形码进行分配，并通过切断条形码和引物序列进行截断。成对的侧读使用FLASH（V1.2.8）进行合并。根据fqtrim（v0.94），在特定的过滤条件下对原始标签进行质量过滤，获得高质量的干净标签。Vsearch（V2.3.4）将相似度为97%的序列分配给同一个操作分类单元（operational classification unit, OTU）。为每个OTU 选择一个有代表性的序列，然后使用RDP（核糖体数据库项目）分类器为每个有代表性的序列分配分类数据。

利用Mafft 软件（V7.310）对不同类群优势种间的差异进行多序列比对，研究不同OTU 的系统发育关系。OTUs 丰度信息按照最小序列样本对应的序号标准进行归一化。采用alpha 多样性法，采用Chao1、Good′s Coverage、Shannon 和3 个指标对样本的多样性复杂度进行分析。我们的示例中的所有这些指标都是使用QIIME（版本1.8.0）计算的。多样性分析用于评价样本物种复杂性的差异。采用QIIME 软件（version 1.8.0）PCoA和聚类分析计算beta多样性。

2.2.5 HE染色

连梅汤治疗后第14 天处死小鼠。立即收集肝脏组织，4%的多聚甲醛固定3 天，脱水，制备5 μm 厚石蜡切片。苏木精伊红（HE）染色光镜下观察组织病理变化。显微镜下观察肝脏组织的脂肪变性和空泡变性，评估肝脏组织的病理改变。

2.3 统计分析

所有实验数据均以至少三个独立实验的平均数±标准差（SD）表示。实验结果使用SigmaPlot（Systat 软件Inc，美国）进行分析。差异的统计学意义采用学生t检验确定，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.4 结果

2.4.1 连梅汤对糖尿病模型小鼠血糖和血脂的调节作用

与C57BL/6J 空白组比较，db/db 糖尿病对照组小鼠的空腹血糖、进食后血糖、血清中FFA、血清中INS有显著差异（P＜0.05）。与对照组比较，阳性药二甲双胍能够显著降低这些不良反应。同时，不同浓度实验药物连梅汤都对db/db 糖尿病小鼠的空腹血糖、进食后血糖、血清中FFA、血清中INS 均有一定的抑制作用。与对照组比较，连梅汤高剂量能够显著降低血液游离脂肪和胰岛素的水平（P＜0.05），差异有统计学意义（表1）。

表1 各组小鼠血糖、血清中FFA和INS浓度的变化（n=6，± SD）

表1 各组小鼠血糖、血清中FFA和INS浓度的变化（n=6，± SD）

注：模型组与空白组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；其余组与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

检测指标空腹血糖进食后血糖血清中FFA血清中INS空白组8.95±1.11 10.07±2.79 18.669±9.751 7.573±1.183对照组16.27±6.27*19.67±3.81*44.858±8.734**14.568±1.505**阳性药11.53±0.79 13.13±1.01 27.370±8.404##11.076±4.189 #低剂量15.83±3.46 17.92±5.63 37.834±9.863 13.180±2.481中剂量15.53±2.52 15.78±2.30 36.164±5.543 12.538±2.869高剂量13.85±4.37 19.68±6.63 32.221±9.767#11.013±1.003#

2.4.2 连梅汤对糖尿病模型小鼠肝脏功能的影响

与空白组小鼠比较，对照组小鼠血清的TC、AST、ALT、HDL-c、LDL-c 水平显著增加（P＜0.01），而TG水平维持稳定（P＞0.05）。与对照组比较连梅汤能显著下调ALT 的水平，且在低剂量组的下降率约为50%，中剂量组下降率约为30%。连梅汤治疗组中TC、AST、HDL-c、LDL-c 在血液中的水平均在低剂量组处于最低，甚至比阳性药治疗组的效果更显著（表2）。

表2 各组小鼠肝脏功能相关指标的变化（n=6，± SD）

表2 各组小鼠肝脏功能相关指标的变化（n=6，± SD）

注：模型组与空白组相比，*P＜0.05，***P＜0.001；其余组与模型组相比，#P＜0.05。

检测指标ALT TG LDL-C HDL-C TC AST空白组47.27±21.05 1.01±0.19 0.32±0.11 1.59±0.41 2.18±0.32 162.63±19.36对照组361.27±39.9***0.96±0.10 0.81±0.20 3.01±0.26 4.19±0.48*288.07±55.45*阳性药225.67±86.17 0.94±0.17 0.74±0.21 2.95±0.36 4.18±0.53 357.63±42.68低剂量148.53±44.59#0.89±0.06 0.61±0.23 2.75±0.18#4.33±1.083 289.13±48.95中剂量191.83±44.59#0.85±0.06 0.78±0.18 2.62±0.38 3.81±0.56 230.35±77.85高剂量215.97±50.54#0.83±0.23 0.74±0.23 3.01±0.55 2.79±0.49#217.37±26.47#

2.4.3 连梅汤对糖尿病模型小鼠肝组织病理变化的保护作用

C57BL/6J 空白组小鼠肝脏组织被膜完整，肝小叶分叶不明显，肝索排列较为整齐；中央静脉内皮完整，肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，形态正常，未见明显变性坏死。对照组则出现不同程度肝细胞坏死，见胞核固缩、崩解，胞质溶解，细胞结构模糊不清，可见明显的肝细胞脂肪变性。与对照组比较，阳性药物及连梅汤不同剂量治疗组则未见明显病理改变。黄色箭头所指为肝细胞空泡突变，蓝色箭头所指为脂肪变性处（图2）。

图2 连梅汤水煎液对C57BL/6J和db/db糖尿病模型小鼠肝脏组织形态变化影响。

2.4.4 连梅汤对糖尿病模型小鼠肠道菌群组成的影响

各组小鼠在门水平和属水平的肠道菌群组成如图3A和图3B。在门水平，厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）等为主要的优势菌群，相对丰度较高。在门水平，相较于空白组、对照组，不同剂量的连梅汤均可以显著提高拟杆菌的丰度，而对厚壁菌门则有一定的抑制作用。在属水平，连梅汤治疗组可以显著抑制肠杆菌、酵母菌的量，同时降低了肠道微生物的相对丰度。如下图3C所示，在门水平厚壁菌门在连梅汤低剂量含量最低，拟杆菌门对连梅汤的响应具有剂量依赖的关系。然而，放线菌门（Actinobacteria）则在空白组和对照组以及连梅汤的治疗下并未出现明显的规律。如下图3D所示，属水平的菌群大都对连梅汤具有明显的响应，连梅汤对乳杆菌（Lactobacillus）的含量具有显著的抑制作用，对颤螺菌属（Oscillospira）的生长繁殖具有促进作用。拟杆菌属（Bacteroides）、嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia）、普氏菌（Prevotella）等在灌胃连梅汤的小鼠肠道内的水平均出现不同程度的增加。以上结果表明C57BL/6J小鼠和db/db糖尿病模型小鼠在门水平肠道微生物结构上无明显差异，在属水平上也差异较小。本实验结果显示，连梅汤在门和属水平都对肠道微生物有明显的调节作用，能显著改变菌群的相对丰度，并对拟杆菌门和乳酸菌属影响显著。

图3 菌群组成分析

2.4.5 连梅汤对糖尿病模型小鼠肠道菌群多样性的影响

本实验通过Alpha 多样性反映连梅汤对糖尿病小鼠微生物群落的丰度和多样性影响。连梅汤治疗组Chao1 指数大于空白组和对照组，表明菌群数越多。Shannon 指数反映菌群的多样性，Shannon 指数越大菌群多样性越高。6组样本中空白组Shannon指数最小，连梅汤中、高剂量组较高。以上结果表明，连梅汤对调节小鼠肠道菌群多样性有显著效果，这有可能是连梅汤中的降糖成分发挥了积极作用（图4A）。Beta 多样性通过主坐标分析（principal coordinate analysis，PCoA），横坐标为Axis1，贡献率为11.5%，纵坐标为Axis2，贡献率为9%，可以代表大部分变量信息。PCoA 在空白组与对照组之间分布呈显著离散分布，而连梅汤治疗组中低、剂量之间高度聚拢，表明连梅汤中、低剂量这两组在相应维度中的群落组成十分相似（图4B）。

图4 菌群多样性分析

3 讨论

随着现代社会的快速发展，人们的生活方式发生了巨大的变化，尤其是饮食习惯。饮食中盐、糖和脂肪的过量摄入导致慢性代谢性疾病，如肥胖和糖尿病的发病率增加。糖尿病已成为我国日益突出的社会健康问题，T2DM 带来的健康问题尤为严重，T2DM 在糖尿病前期人群中的发病率高达35.5-70.4/1000 人/年[12]。因此，本研究以传统中医药为突破口，使用经典方剂连梅汤对db/db 糖尿病模型小鼠进行治疗。在实验期间，可以观察到连梅汤治疗组降低了db/db 小鼠的血糖和血脂，同时也对糖尿病小鼠的肝脏功能具有一定的保护作用。其次，通过16SrDNA 高通量测序发现，连梅汤虽然使模型小鼠的丰度下降了，但却增加了肠道的微生物种类。

糖尿病（消渴症）在传统中医典籍里已经有较多报道，晋朝的陈延之在《小品方》就已经提出消渴病尿甜为肾气不固、精微下流所致[13]。隋代的甄立言在《古今录验方》不仅提出了消渴病尿甜的现象，而且还对消渴病、消中、肾消进行了鉴别[14]。连梅汤以酸甘化阴，苦味坚阴为基调，具有清心泻火，滋肾养液的功效。将连梅汤应用到糖尿病（消渴症）的治疗中，已被大量现代医家报道。因此，通过调控肠道菌群的组成在T2DM 的治疗过程中起着相当重要的作用，为中药治疗疑难杂症提供了新的思路。目前，已有现代基础医学研究证实肠道菌群与T2DM 反应密切相关[9]。Membrez 等[15]研究发现，诺氟沙星和氨比西林对饮食诱导肥胖（DIO）小鼠血糖得到控制，空肠TNF-α 水平降低，提示抗生素对肠道菌群的调节可降低炎症反应水平，增加糖耐量。其抗生素治疗T2DM 的机制是通过调节胰岛A 细胞膜上γ-氨基丁酸A 型受体（GABAA）的活性，抑制胰高血糖素的分泌进而控制血糖。但抗生素属于易过敏药物，不良反应较多，且容易产生耐药性。基于以上结论，通过传统中药减轻西药使用过程中的副作用，显得很有必要。

T2DM 严重影响患者身体健康，并伴有脂代谢紊乱等一系列的疾病[16]。T2DM 病人常伴有脂肪肝、胆固醇（T-CHO）、甘油三酯（TG）、空腹胰岛素、C-肽水平明显增高，而高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇LDL-C 则无显著变化[17-18]。与上述结果一致，本实验中在连梅汤的治疗作用下，胆固醇和甘油三酯的水平均有不同程度的降低。肝脏作为脂类的消化、吸收、运输、分解代谢和合成代谢的工厂，与脂代谢密切相关[19]。在连梅汤的治疗下db/db 小鼠肝脏组织病理变化得到恢复。同时，肠道菌群已被报道与脂代谢和肥胖具有密切的联系，肥胖患者存在肠道菌群异常，出现厚壁菌门增加，拟杆菌门减少，将肥胖型小鼠肠道菌群接种于无菌小鼠，无菌小鼠体重明显增加，说明肠道菌群能够影响宿主的代谢[20-21]。灌胃连梅汤的db/db 小鼠出现了厚壁菌门含量降低，拟杆菌门水平升高，这说明连梅汤对脂代谢是具有促进作用。本研究针对2 型糖尿病，旨在通过调整肠道菌群失衡来改善宿主代谢，探讨连梅汤对db/db 小鼠菌群紊乱及脂代谢异常的恢复作用，为T2DM 的治疗提供参考。

4 结论

综上所述，连梅汤具有降糖、降脂和保肝的作用，可以显著改善T2DM 小鼠的血糖、血脂代谢紊乱，并能减轻肝脏损伤。连梅汤对糖尿病的治疗效果确切，其发挥功能的机制可能与调节肠道菌群有关，但其具体机制仍不清楚，需要进一步的研究去验证其治疗机制。通过连梅汤探索传统中药对于防止糖尿病和糖尿病诱发的动物肝脏病变具有重要的临床意义，值得在今后的研究中进一步探讨。