外泌体在慢性乙型肝炎和HBV相关肝细胞癌发生发展中的作用机制

郭紫薇， 陈贺宁， 曹 旭， 张嘉鑫， 张宁怡， 靳 茜， 李小科， 叶永安

1 北京中医药大学东直门医院 脾胃病科， 北京 100700； 2 北京中医药大学 第一临床医学院， 北京 100029

HBV感染被认为是我国肝细胞癌(HCC)发生发展的主要危险因素，持续的HBV感染会导致慢性乙型肝炎(CHB)并增加终末期肝病包括肝硬化和HCC的风险。因此，HBV感染的早发现、早诊断对于抑制HBV慢性感染，防止CHB进展至HCC具有重要的临床意义。近年来，外泌体作为一种由细胞分泌的纳米级囊泡，以内含丰富核酸、蛋白质和脂类等生物分子为特性，不仅能够特异性靶向宿主细胞的膜蛋白，启动下游信号，而且能够将遗传物质传递到细胞质中，为细胞间通讯提供了另一种途径，逐渐成为当前各领域的研究热点。同样，在HBV感染进展至CHB或HCC的过程中，外泌体充当病毒或肿瘤细胞异质种群与邻近细胞以及远处细胞之间交换“货物”的载体，影响着疾病的进展。迄今为止，外泌体的生理功能仍未完全明确，本文综述了外泌体的结构、功能及其在HBV感染、HCC进展中的调控机制和信号转导途径，希望为今后的CHB和HCC治疗方案提供有益线索。

1 外泌体的结构及通讯作用

外泌体于1983年首次在绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone等将其命名为“exosome”[1-2]。现今，其特指由所有真核细胞产生，被双层脂质膜包裹，直径在40～100 nm的盘状囊泡[3]。

外泌体中含有一些重要的生物活性分子，如DNA、RNA、mRNA等。由于其特殊的生成方式，其中含有的细胞质膜、核内体等蛋白质成分要比高尔基体、细胞核、线粒体等相关蛋白质成分多。外泌体还包含主要相容组织复合物(major ribouncleic acid，MHC)；四跨膜蛋白超家族，如CD81、CD82和肿瘤易感基因101(TSG101)等[4]。同时，由于外泌体具有脂质双分子层，包裹在里面的核酸、蛋白质等生物分子能保持稳定活性，被受体细胞摄取后能够发挥多方面的生物学作用，如细胞信号传导、基因调控、免疫调节等。

外泌体主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中，可在血液、尿液和其他体液中检测到[5-6]。外泌体的主要功能是细胞间通讯，即在邻近和远处细胞之间穿梭各种信号分子[7]，如图1所示。外泌体可以通过未知的受体与靶细胞相互作用，包括位于初级纤毛的受体，并激活下游的细胞内信号通路[8]。它们还可以直接与细胞膜融合，将外泌体膜蛋白整合到质膜上或被内吞，将生物大分子、功能蛋白及核酸运送到受体细胞的细胞质中[9]。因此，外泌体作为细胞与细胞之间物质和信息的“运输载体”，介导并参与了病毒和宿主细胞的相互作用[10-12]，完成其通讯功能。且在免疫系统中, 外泌体已经被证明在介导适应性和先天性免疫应答中起关键作用，通过传播MHC-Ⅱ和MHC-Ⅰ分子相关的抗原来参与抗原递呈。

图1 外泌体通讯作用示意图

Bukong等[13]从丙型肝炎患者血浆中分离的外泌体中存在HCV RNA，这些外泌体以不依赖受体的方式将HCV传播给正常肝细胞。这与Dreux等[14]的研究相似，该研究发现HCV RNA被包裹在肝细胞来源的外泌体中，并转移到浆细胞样树突状细胞中诱导干扰素(IFN)α的产生。早前在单纯疱疹病毒的研究[15]中发现，单纯疱疹病毒感染细胞分泌的外泌体可将病毒的被膜蛋白和糖蛋白等转运至未感染的受体细胞, 从而促进潜伏病毒的再激活、扩大病毒的感染、增加组织细胞对单纯疱疹病毒的易感性。以上研究均表明外泌体介导病毒细胞间的传递，并可作为潜在的免疫逃避或应答机制，在细胞与细胞之间的通信交流方面起着重要的作用。

2 外泌体与HBV感染

全世界大约有2.5亿人被HBV感染，持续的HBV感染会导致CHB并增加终末期肝病包括肝硬化和HCC的风险[16-17]。外泌体作为细胞间重要的通讯工具，在参与HBV感染期间的病毒传播、免疫调节和抗病毒反应中扮演重要角色[18]。然而，已有相关病毒学研究表明，外泌体在HBV感染过程中发挥着“双刃剑”作用。一方面，病毒可以“挟持”外泌体并将自身携带的病毒成分及某些基因编码蛋白质装入其中，逃避宿主的免疫应答，促进其在细胞间的传播。另一方面，宿主细胞也可利用外泌体介导抗病毒通路，传递抗病毒因子起到抑制病毒的作用[19]。

2.1 外泌体的促HBV感染作用 由于外泌体的生成过程与许多疾病进展通路有相当大的重叠，所以有相关学者认为病毒可利用外泌体携带的病毒RNA、细胞miRNA、蛋白质及其他宿主功能性遗传元件发挥其信息载体作用介导HBV感染通路，逃避免疫监视而产生感染[20-21]。刘娇等[22]发现CHB患者血清外泌体与HBV DNA载量密切相关，其中外泌体miR-122随HBV DNA载量增加而升高，miR-146a水平呈相反趋势，二者可能拮抗影响HBV DNA复制。聚乙二醇化干扰素α是推荐的抗HBV药物，然而，其对CHB患者的治疗结果仍然不是最佳。四川大学华西医院团队[23]下载并分析了对IFNα具有不同反应的CHB患者的基因表达谱，发现先天免疫状态与CHB患者中基于IFNα的治疗反应相关，该研究发现外泌体介导IFITM2向树突状细胞的转运抑制了IFNα合成，导致外源性IFNα处理下的IFN途径出现了应答障碍，从而抑制外源性IFNα的抗HBV效应，导致HBV持续感染进展至CHB。以上研究提示外泌体可能是HBV传播的重要调节剂，介导了HBV细胞间的传播，并可能具有调节先天免疫应答的作用，充当潜在的免疫逃逸机制。其次，有研究表明，HBV可能利用外泌体改变微环境，使其利于病毒的复制和传播。如Yang等[24]通过荧光电镜和流式细胞术，发现在CHB患者血清中存在的外泌体同时含有HBV核酸和HBV蛋白，并以主动的方式将HBV转移到肝细胞。

2.2 外泌体的抗HBV感染作用 作为抵抗病毒感染的主要宿主防御系统，IFN家族可诱导抗病毒基因的表达，如IFNα具有抑制HBsAg和HBV共价闭合环状DNA的能力，启动有效的抗病毒反应，因此外泌体可能通过激活人体的免疫功能来应对感染[25]。相关研究[26]表明IFNα可诱导细胞表达人胞苷脱氨酶 (APOBEC3G，A3G) 抵抗HBV的感染。通过荧光标记试验发现，在IFNα的刺激下，肝非实质细胞能够通过释放外泌体，将A3G递送至被感染的肝实质细胞，恢复肝实质细胞的抗病毒能力[27]。巨噬细胞来源的外泌体利用病毒内吞和胞饮作用将巨噬细胞中与IFNα相关的miRNA转移到感染HBV的肝细胞中，有效转移IFNα诱导的抗HBV活性[28]。因此，宿主细胞可通过利用外泌体传递抗病毒因子抑制病毒感染[29]。该作用不仅为有效控制肝细胞中HBV的复制提供了应用前景，也暗示了解外泌体的细胞进入机制和途径有助于将外泌体作为抗病毒治疗的有效载体的设想得以实现。

3 外泌体与HCC的发生发展

原发性肝癌是目前我国第4位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因，其中，HCC 是原发性肝癌最常见的恶性肿瘤。HBV感染是其最主要的危险因素，国内HCC患者HBV感染率高达80%，严重威胁我国人民的生命和健康[30]。肿瘤组织不仅包括癌细胞，还包括如癌症相关成纤维细胞(cancer associated fibroblast, CAF)、内皮细胞、细胞外基质等间质成分在内。HCC细胞与这些间质成分之间相互作用构成了肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)。外泌体携带功能活跃的蛋白质、RNA 和其他类型的分子通过改变受体细胞的表型和功能调控着HCC发生发展中的多种信号通路,主要表现为参与癌症的血管生成、转移和免疫抑制[31-34]。

3.1 外泌体调节肝癌细胞的生长和转移 在一项通过观察20例HBV阳性HCC患者和3例HBV阴性HCC患者中miR-3表达的研究[35]，发现肝组织来源的miR-3在HBV阳性HCC细胞中高表达，而在HBV阴性HCC细胞中不表达，该研究提示在HBV感染者的HCC细胞中，一种HBV编码的miRNA，即miR-3，被外泌体和HBV核心颗粒释放到循环中，参与了HCC的发生、发展。研究表明，HCC细胞来源的外泌体介导了HCC细胞与其周围微环境之间的相互作用，使正常细胞转化为肿瘤细胞。例如，HCC细胞来源的外泌体向受体细胞传递功能性miR-21，导致肝星状细胞中PDK1/AKT信号的激活。这反过来又将肝星状细胞转化为CAF。活化的CAF分泌血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶2(MMP2)、MMP9、碱性成纤维细胞生长因子和TGFβ等细胞因子进一步促进癌症的发展。此外，含有miR-21和miR-29a的外泌体与免疫细胞中的Toll样受体结合，激活Toll样受体中的NF-κB通路，分泌一系列炎症因子，促进肿瘤生长和转移[36-38]。除HCC细胞外，其他细胞亦可分泌外泌体促进HCC生长，减少DNA损伤。例如，Zhang等[39]研究证明，脂肪细胞可以通过降低miR-34a和激活USP7/Cyclin A2信号通路在肿瘤生长中释放出外源性环状RNA并减少DNA损伤。

3.2 外泌体对肝癌血管生成的影响 HCC是高度血管生成性癌症，肿瘤的生长需要血管提供各种营养成分。外泌体可通过蛋白质、RNA等调控细胞间通讯，导致肿瘤内异质性的改变，诱导血管管腔形成，最终促进肿瘤细胞的恶性增殖及侵袭性细胞表型的形成。如Lin等[40]研究发现，HCC细胞分泌的外泌体miR-210可通过靶向SMAD4和STAT6转移至内皮细胞，促进肿瘤血管生成。Yukawa等[41]发现HepG2-exosomes表达免疫细胞的激活受体NKG2D和HSP70 (一种应激相关的热休克蛋白)，两者都作用于血管内皮生长因子受体导致血管生成。此外，HCC细胞分泌的外泌体miR-103可通过作用于内皮细胞增加血管通透性，促进肝癌转移[42]。上海交通大学有相关研究[43]通过蛋白质印迹检查LOXL4对FAK/Src途径的影响，发现LOXL4在HCC组织中常被上调，并预测预后不良，升高的LOXL4与肿瘤分化、血管侵袭和肿瘤-淋巴结转移阶段相关。此外，HCC衍生的外泌体通过旁分泌机制将LOXL4转移至人脐静脉内皮细胞以促进血管生成。

3.3 外泌体在肝癌免疫中的作用 新的研究证据[44-46]表明，肿瘤来源的外泌体是导致T淋巴细胞功能障碍的主要因素之一，其携带多种免疫抑制信号，驱动T淋巴细胞功能障碍以欺骗免疫细胞和逃避免疫监视，实现肿瘤免疫。研究[47]发现，肿瘤来源的外泌体通过刺激巨噬细胞增加IL-1β、IL-6、IL-10 和 TNFα的分泌，激活STAT3途径并增加其分泌来抑制免疫细胞的活化，从而导致免疫逃逸。此外，CAF通过分泌各种细胞因子、生长因子、趋化因子、外泌体和其他效应分子，与肿瘤浸润免疫细胞以及TME内的其他免疫成分相互作用，形成免疫抑制性TME，使癌细胞能够逃避免疫系统监视。对CAF和免疫微环境相互作用的深入研究，特别是将CAF与免疫细胞联系起来的复杂机制，可能为后续的靶向免疫治疗提供新的策略[48-50]。此前，有研究报道肝特异性果糖1,6-双磷酸酶1(fructose-1, 6-bisphosphatase 1,FBP1) 在HCC组织中普遍受到抑制，其缺失可促进肝脏肿瘤发生并诱导与人类HCC非常相似的代谢和免疫扰动。中山大学Liu等[51]在其研究中使用二乙基亚硝胺诱导HCC小鼠模型，分析了从对照和FBP1耗尽的肝脏中纯化的免疫细胞群的潜在变化，报告了FBP1缺陷的肝脏表现出自然杀伤(NK)细胞数量减少和肿瘤发生加速。因此，肝脏FBP1耗竭促进了HCC相关的免疫重塑，部分是通过将肝细胞分泌的、PKLR减弱的细胞外囊泡转移到NK细胞。这与Kouwaki等[52]的研究相一致，该研究发现HCC中感染的HBV可诱导外泌体miR-21和miR-29，抑制巨噬细胞和树突状细胞并释放 IL-12，IL-12 激活NK细胞，从而破坏先天免疫反应。

4 小结与展望

综上，在慢性HBV感染中，外泌体既可以包膜的形式转运肝炎病毒，促进其复制传播、免疫逃避，也可能成为免疫治疗的靶点，介导抗病毒反应。在HCC的发生发展中，一方面，外泌体可通过细胞间通讯促进肿瘤的发生发展、侵袭、转移，另一方面，也可以携带物质进入细胞，作为肿瘤治疗药物的运送载体，从而诱导抗肿瘤免疫反应，或抑制肿瘤细胞来源的外泌体的分泌。因此，外泌体不仅参与了CHB和HCC的发生和发展，还可能为HBV感染相关性肝脏疾病的治疗提供新的线索。然而，笔者认为，目前外泌体的分离具有其固有的异质性和生物流体的复杂性，且外泌体在肝脏中的发生、释放以及与靶细胞相互作用的精确分子机制较少。如何增强外泌体的抗病毒免疫原性、打破免疫耐受、根据TME特点优化现有免疫治疗策略、发掘高灵敏度外泌体检测方法等仍是目前面临的问题与挑战。希望在不久的将来，通过深入研究外泌体及外泌体中的内容物，为HBV相关慢性肝炎或HCC提供可靠的早期诊断的生物标志物及特异性的治疗靶点。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：郭紫薇、陈贺宁、曹旭负责设计研究，资料分析，撰写论文；郭紫薇、张嘉鑫、张宁怡、靳茜参与检索文献，数据提取，修改论文；李小科、叶永安负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。