冷等离子体处理对草地早熟禾幼苗抗盐性的影响

张玉娟， 郭 睿， 张兆恒， 张 岩， 马晖玲， 董文科

(甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心， 甘肃 兰州 730070)

随着社会的发展、城市化进程的推进，草坪作为人类生活环境与现代文明的重要组成部分，具有易养护、耐践踏、可大面积种植用于运动、娱乐等其他地被花卉、乔灌木植物所不具备的优点[1-3]，在我国发展迅速。草地早熟禾(Poapratensis)是一种根茎疏丛型禾草，具有强壮的地下根系可快速形成致密的草皮，并且质地纤细柔嫩、草姿优美，耐寒、耐旱[4]，分布范围广[5]，已成为城市草坪建植中主要使用的冷季型草坪草之一[6]，广泛应用于功能草坪建植以及生态环境治理。土壤盐渍化是植物主要的非生物胁迫因素之一。经调查研究发现，全球五分之一的耕地和近半数的灌溉土地均受到不同程度的盐害威胁[7-8]。仅在我国盐渍化土壤面积就高达3 460万hm2[9]，尤其在北方地区土地中，氯化物盐的含量较高，盐分的累积导致植物代谢过程损伤、光合作用效率降低[10]，严重影响草坪草的生长发育，制约北方草坪的建植和绿色产业的发展[11]。

冷等离子种子播前处理技术是由俄罗斯科学家发明的一项低风险、低投入、可批量重复的种子处理新技术[12]，主要由离子、电子、自由基等活性粒子及可见光、紫外线等组成[13]，在特定压强下通过不同的放电方式使种子的生物大分子能量由基态跃迁到激发态，进而对种子产生积极的生物学效应[14]。研究指出经过冷等离子处理的种子可提高作物产量[15]、种子发芽率[16]、增强植物抗逆性[17-18]。同时，冷等离子体处理技术相较于其他处理技术具有无污染和废弃物等特点，已在世界范围内得到了广泛应用并取得良好效果。为此，本试验利用冷等离子体处理技术对草地早熟禾‘午夜’种子进行播前处理，测定不同盐胁迫下萌发后草地早熟禾幼苗的相关生长和生理指标，分析不同冷等离子体处理功率后对草地早熟禾抗盐性的影响，旨在为盐渍土草坪建植提供数据支持，同时也为提高禾本科作物耐盐性提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料与种子处理

以草地早熟禾‘午夜’种子为试验材料，种子由北京克劳沃草业有限公司提供。利用冷等离子体表面改性处理仪(HD-1B型，常州新区世泰等离子体技术开发有限公司)对‘午夜’种子进行改性处理，分别设置低功率(10 W)、中功率(80 W)和高功率(120 W)三种不同处理强度，处理时间为10 min，气压为40 Pa，使用氮气作为保护气体，反应室要求抽真空。以未经冷等离子体处理的种子作为对照(CK)。

1.2 试验方法

1.2.1幼苗的培养 选择籽粒饱满、大小均匀的冷等离子体处理后的种子，经20%的NaClO消毒后均匀的播种在含有无杂质细沙的育苗钵(直径10 cm，深15 cm)中，放置在人工培养箱内培养，每天光照16 h，光照强度为5 000 lx，昼夜温度为(25±1)℃，相对湿度为60%～70%，出苗1 cm后，每周浇灌一次Hoagland’s营养液。待草地早熟禾幼苗长至10 cm时，间苗至每钵40株，进行下一步试验。

1.2.2盐胁迫处理 待草地早熟禾幼苗长至10 cm时进行不同NaCl盐浓度(0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol·L-1)的胁迫处理，在胁迫期间用蒸馏水补充散失的水分，保证盐浓度恒定。盐胁迫7天后测量幼苗生长状况指标，并取样测定相关生理指标。试验设置每6钵为一盆，每3盆为一个重复，每个处理3次重复。

1.3 指标测定

1.3.1生长指标的测量 随机从各处理中取3株幼苗测量草地早熟禾地上自然高度为苗长，用蒸馏水将根系冲洗干净后测量根基部到根尖的长度为根长。

1.3.2生理指标的测定 将相同处理下的幼苗用剪刀从根基部剪下后混合均匀，取0.2 g叶片测定其生理指标。叶绿素含量采用丙酮法[19]测定；MDA含量采用硫代巴比妥酸法[20]测定；Pro含量采用磺基水杨酸提取法[21]测定；可溶性糖含量采用蒽酮法[22]测定；可溶性蛋白采用考马斯亮蓝染色法[23]测定。SOD活性采用氮蓝四唑显色法测定[24]；POD活性采用愈创木酚法测定[25]；CAT活性采用紫外比色法测定[26]。

1.4 数据分析

SPSS 19.0软件进行统计分析，采用单因素ANOVA对多组样本进行分析处理，Duncan’s新复极差法进行显著性方差分析；采用Microsoft Excel 2010进行绘图与数据处理。

2 结果与分析

2.1 冷等离子体处理对盐胁迫下草地早熟禾幼苗生长的影响

如图1所示，冷等离子体处理对草地早熟禾在盐胁迫下的生长有一定的促进作用，但不同的处理功率间存在差异。无NaCl胁迫时，经冷等离子体处理后的苗长和根长均高于CK。随着NaCl浓度的上升，苗长在其浓度为0～0.1 mol·L-1和0.3 mol·L-1时经80 W和120 W功率处理后的值显著高于CK和10 W(P<0.05)，且苗长在NaCl浓度为0.4 mol·L-1时80 W的处理功率效果最好，120 W功率处理后的效果与80 W处理间差异显著(P<0.05)且低于10 W。经120 W功率处理后的根长在NaCl浓度为0～0.5 mol·L-1时与CK和10 W处理间差异显著(P<0.05)，经80 W处理后的根长在NaCl浓度0～0.2 mol·L-1时与10 W处理功率间差异不显著，但与CK之间差异显著(P<0.05)，且与CK相比，同一NaCl浓度下的根长随着处理功率的加强呈上升趋势。

图1 冷等离子体处理对盐胁迫下草地早熟禾幼苗生长的影响Fig.1 Effects of cold plasma treatment on the growth of Poa pratensis seedlings under salt stress注：不同大写字母表示同一盐浓度下不同处理功率之间差异显著(P<0.05)；不同小写字母表示同一处理功率下不同盐浓度之间差异显著(P<0.05)。下同Note:Different capital letters indicate significant differences between the different power of treatments at the same salt concentration at the 0.05 level;different lowercase letters indicate significant differences between different salt concentrations at the same treatment power at the 0.05 level. The same as below

2.2 冷等离子体处理对盐胁迫下草地早熟禾幼苗生理特性的影响

2.2.1对叶绿素含量的影响 由图2可知，不同冷等离子体处理功率对草地早熟禾在盐胁迫下叶绿素含量的影响存在一定的差异。无NaCl胁迫时，120W的处理功率对叶绿素的含量有所降低，是对照的98.4%，但其余各功率处理均提高了叶绿素含量。在NaCl胁迫下，经过冷等离子体处理后的叶绿素含量均高于CK，其中在0.3 mol·L-1和0.5 mol·L-1的NaCl浓度下三个功率处理后的叶绿素含量均与CK差异显著(P<0.05)，而在NaCl浓度为0.1～0.2 mol·L-1和0.4 mol·L-1时经120 W功率处理的叶绿素含量与CK差异不显著。此外，NaCl浓度为0～0.5 mol·L-1时经80 W功率处理后的叶绿素含量与CK，10 W和120 W处理后的差异显著(P<0.05)。

图2 冷等离子体处理对盐胁迫下草地早熟禾幼苗叶绿素 含量的影响Fig.2 Effect of cold plasma treatment on chlorophyll content of Poa pratensis seedlings under salt stress

2.2.2对可溶性糖含量的影响 如图3所示，在同一盐胁迫下，经冷等离子体处理后草地早熟禾可溶性糖的含量均显著高于CK(P<0.05)。同一处理功率后的可溶性糖含量在各盐浓度下存在差异，在NaCl胁迫浓度为0～0.1 mol·L-1时，120 W的处理效果最佳，且在0.1 mol·L-1时达到最大，但随着NaCl浓度的增加该功率处理下的可溶性糖含量逐渐降低，在0.5 mol·L-1时低于10 W处理后的含量。反之，经80 W的功率处理后的可溶性糖含量在NaCl浓度为0.2～0.5 mol·L-1时高于10 W和120 W处理，且在NaCl浓度为0.3～0.5 mol·L-1时显著高于其他三组处理(P<0.05)。

图3 冷等离子体处理对盐胁迫下草地早熟禾幼苗可溶性糖 含量的影响Fig.3 Effect of cold plasma treatment on soluble sugar content of Poa pratensis seedlings under salt stress

2.2.3对可溶性蛋白含量的影响 如图4所示，冷等离子体处理对盐胁迫下草地早熟禾的可溶性蛋白具有显著影响，整体表现为随着盐浓度的增加可溶性蛋白呈先上升后下降的趋势，但变化趋势又因盐浓度的差异而不尽相同。未经冷等离子体处理的可溶性蛋白含量在盐浓度为0～0.1 mol·L-1时呈上升趋势并在0.1 mol·L-1时达到最大，且高于10 W功率处理后的含量。经冷等离子体处理后，在无盐胁迫时80 W和120 W功率处理后的含量显著高于CK和10 W处理(P<0.05)；有盐胁迫时，当NaCl浓度为0.2～0.5 mol·L-1时经冷等离子体处理后的可溶性蛋白含量均显著高于CK(P<0.05)，且无论有无盐胁迫均以120 W处理后的效果最佳。

图4 冷等离子体处理对盐胁迫下草地早熟禾幼苗 可溶性蛋白含量的影响Fig.4 Effect of cold plasma treatment on soluble protein content of Poa pratensis seedlings under salt stress

2.2.4对丙二醛(MDA)含量的影响 由图5可知，各冷等离子体处理功率下的MDA含量随盐胁迫浓度的增加呈持续上升的趋势，但增幅因处理功率的不同而存在差异。当盐胁迫浓度为0～0.1 mol·L-1时，经冷等离子体处理的含量与未经冷等离子体处理的CK差异不显著。但当NaCl浓度上升至0.2～0.4 mol·L-1时，经冷等离子体处理后的MDA含量显著低于CK(P<0.05)，且经80 W功率处理后的MDA含量最低。当NaCl浓度为0.5 mol·L-1时，CK与10 W处理后的MDA含量差异不显著，但显著高于80 W和120 W功率处理后含量(P<0.05)且CK的含量分别是它们的1.23和1.22倍。

图5 冷等离子体处理对盐胁迫下草地早熟禾 幼苗丙二醛含量的影响Fig.5 Effect of cold plasma treatment on MDA content of Poa pratensis seedlings under salt stress

2.2.5对游离脯氨酸(Pro)含量的影响 如图6所示，随盐胁迫浓度的增加，经120 W功率处理后的Pro含量呈持续上升趋势，而其他各功率处理下的Pro含量均呈先上升后下降的趋势。其中，CK和10 W功率处理下的Pro含量在NaCl浓度为0.3 mol·L-1时达到最大且显著高于120 W功率处理后的含量(P<0.05)，分别是其1.18和1.20倍；80 W处理下的Pro含量在NaCl浓度为0.4 mol·L-1时达到最大，较无盐胁迫时增加了2.3倍，在整个胁迫过程中80 W处理后的含量均显著高于其他三个处理(P<0.05)。

图6 冷等离子体处理对盐胁迫下草地早熟禾幼苗 游离脯氨酸含量的影响Fig.6 Effect of cold plasma treatment on Pro content of Poa pratensis seedlings under salt stress

2.2.6对抗氧化酶(SOD,POD和CAT)活性的影响 如图7所示，冷等离子体处理对盐胁迫下草地早熟禾抗氧化酶活性具有显著影响。

随盐胁迫浓度的增加，草地早熟禾幼苗SOD活性呈先上升后下降的趋势。无盐胁迫时，经80 W和120 W功率处理后的SOD活性高于CK但差异不显著；盐胁迫浓度为0.1 mol·L-1时80 W处理下的SOD活性上升幅度较大并显著高于其他处理(P<0.05)，在NaCl浓度为0.2～0.4 mol·L-1时仍维持在较高水平；同样，经120 W处理后的SOD活性虽低于80 W处理后的活性，但在盐浓度为0.2～0.5 mol·L-1时120 W和80 W功率处理后的SOD活性均显著高于10 W和CK(P<0.05)。

随盐胁迫浓度的增加，不同冷等离子体处理后的POD活性整体呈先上升后下降的趋势，但各处理功率下差异较大。无盐胁迫时，CK和10 W功率处理后的草地早熟禾幼苗POD含量显著高于80 W和120 W处理后的含量(P<0.05)。随着NaCl浓度的上升，80 W和120 W功率处理后的含量在0.3 mol·L-1时达到最大值，分别是无盐胁迫时的1.23和1.20倍。在NaCl浓度为0.4～0.5 mol·L-1时80 W和120 W处理后的POD含量仍显著高于CK和10 W处理(P<0.05)。

随盐胁迫浓度的增加，未经冷等离子体处理的草地早熟禾幼苗CAT活性呈持续下降趋势，而经处理的呈先上升后下降的趋势。无盐胁迫时，CK的CAT活性显著高于经冷等离子体处理后的活性(P<0.05)；盐胁迫浓度为0.1 mol·L-1时，经10 W和80 W功率处理后的CAT活性上升达到最大且显著高于CK(P<0.05)；NaCl浓度为0.2～0.4 mol·L-1时，经冷等离子体处理的CAT活性均显著高于CK(P<0.05)，并且经120 W处理后的CAT活性在NaCl浓度为0.3 mol·L-1时显著提高达到最大，此后随盐浓度的增加虽有所降低但降幅和其他处理功率相比较为平缓。

2.3 冷等离子体处理对草地早熟禾幼苗抗盐能力影响的综合评价

2.3.1相关性分析 如表1所示，对冷等离子体处理后不同盐浓度胁迫下的10个指标的相关性结果表明：不同处理下草地早熟禾的Pro与根长、可溶性糖、可溶性蛋白、SOD和POD之间的相关性未达到显著水平，但与苗长、叶绿素和CAT呈显著负相关(P<0.05)，与MDA呈显著正相关(P<0.05)；MDA与苗长、根长、叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白、SOD,POD和CAT之间呈极显著负相关(P<0.01)；其余各指标间均呈显著正相关(P<0.05)或极显著正相关(P<0.01)。因此，经不同冷等离子体处理下的草地早熟禾幼苗表现出的抗盐能力与各指标间相互牵制、共同协调的作用紧密相关。

图7 冷等离子体处理对盐胁迫下草地早熟禾幼苗抗氧化酶活性的影响Fig.7 Effect of cold plasma treatment on antioxidant enzyme activity of Poa pratensis seedlings under salt stress

表1 不同处理下草地早熟禾幼苗各项指标的相关性分析Table 1 Correlation analysis of various indexes of Poa pratensis seedlings under different treatments

2.3.2主成分分析 为综合评价盐胁迫下不同冷等离子体处理功率对草地早熟禾幼苗的影响，将10个指标进行主成分分析并提取特征值大于1和累积方差贡献率大于80%的主成分。如表2所示，提取的2个主成分的特征值均大于1，分别为7.238和1.177；方差贡献率分别为72.38%和11.775%，累积方差贡献率达到84.154%，因此，用这2个主成分可以反映原始变量的绝大部分信息并进行分析评价。决定第一主成分的主要是苗长、根长、叶绿素、可溶性糖和可溶性蛋白及SOD，POD和CAT，决定第二主成分的有MDA和Pro，说明冷等离子体处理对草地早熟禾幼苗盐胁迫的调节主要是通过形态特征，光合作用，渗透调节物质和抗氧化酶活性，其次是通过膜脂过氧化性来增强抗盐能力。

表2 主成分分析方差解释Table 2 Variance explanation of PCA

2.3.3综合得分排名 用各指标变量的主成分载荷(如表2所示)除以2个主成分相对应特征值的算术平方根，得到2个主成分中每个指标所对应的系数即特征向量，将各指标的原始数据标准化后，以特征向量为权重乘以标准化后的值(X)，分别构建2个主成分的函数表达式F1和F2计算各主成分得分，表达式如下：

F1=0.357X1+0.310X2+0.330X3+0.332X4+0.290X5-0.351X6-0.135X7+0.330X8+0.331X9+0.338X10；

F2=-0.110X1+0.124X2-0.161X3+0.150X4+0.117X5+0.211X6+0.833X7+0.327X8+0.238X9-0.088X10。

用每个主成分得分与对应的累积贡献率的乘积之和计算综合得分F，即：

F=72.38%×F1+11.775%×F2。

如表3所示，草地早熟禾幼苗在不同功率冷等离子体处理下的综合得分分别是-1.56452(CK),-0.30603(10 W),0.99832(80 W)和0.87223(120 W)。因此，冷等离子体处理后对草地早熟禾幼苗抗盐能力影响的排名依次为：中功率(80 W)>高功率(120 W)>低功率(10 W)>CK。

表3 草地早熟禾幼苗在不同功率冷等离子体处理下的综合得分及排序Table 3 The comprehensive score and ranking of Poa pratensis seedlings under different power cold plasma treatments

3 讨论

近年来，冷等离子体种子处理技术正逐渐应用在植物的诱变育种上[27]，一定剂量的冷等离子体对种子处理后可以对多种作物产生积极影响，比如，提高小麦(Triticumaestivum)的发芽率[28]，改善番茄(Solanumlycopersicum)的产量与品质等[29]。研究表明，冷等离子体与种子表面互作时释放的能量会改变种子的生化特征及物理形态[30]。Jiang等[28]用冷等离子体对小麦种子进行处理后发现80 W的处理功率能够显著提高小麦苗期的株高和根长。本研究同样利用冷等离子体处理草地早熟禾‘午夜’种子，通过测定其萌发后幼苗的生长指标后发现无NaCl胁迫时经80 W和120 W处理后的苗长和根长均高于未经处理的对照，说明冷等离子体处理同样对草地早熟禾的生长有促进作用，其可能原因是冷等离子体对种子的生化特征及形态的改变会对种子萌发初期的行为产生积极影响，进而促进植株的生长。同时，研究表明，种子受冷等离子体的诱导刺激后，激活了种子生命力，加速其内部酶和糖类物质的转化，促进植物积蓄后续生长所需的能量，增强植物的抗逆性[31]。多数植物在种子萌发和生长初期对外界胁迫最为敏感，所以常用植物生长初期状况来评价植物抗逆性[32]，本研究发现在盐胁迫下经过冷等离子体处理的草地早熟禾幼苗的生长优于未经处理的，因此冷等离子体对草地早熟禾种子的积极影响在一定程度上对其抗盐性也有所提高。

叶绿素含量直接反映植物的光合作用能力，与植物健康状况密切相关[33]。研究表明，冷等离子体处理对植物幼苗叶片生长的促进作用有利于植物对光能的吸收和光合色素的传递[34]。本试验发现经过80 W和120 W功率处理的草地早熟禾幼苗叶绿素的含量在盐胁迫下明显提高，其原因可能是草地早熟禾对光能的吸收和色素的传递提高了光合效率，光合效率产生的能量可在一定程度上应答NaCl的胁迫[35]。同样，李凯等[36]对冷等离子体处理后的番茄种子在亚高温条件下的光合色素变化及光合作用能力进行研究后也发现冷等离子体处理能够提高植物在胁迫环境的光能利用效率，促进植物在逆境下健康生长。可溶性糖和可溶性蛋白与植物的渗透调节能力有直接关系，是植物忍受不利环境的重要调节物质[37-38]。研究指出，冷等离子体处理能够改变细胞膜结构和胞内物质，增加可溶性糖和可溶性蛋白等代谢物质的含量进而强化植物的生长代谢功能[31,39]。本研究也发现冷等离子体处理可以显著提高草地早熟禾幼苗在盐胁迫浓度为0.2～0.5 mol·L-1下的可溶性糖和可溶性蛋白含量，其原因可能是由于冷等离子体处理对细胞膜结构和胞内物质的改变，有利于可溶性糖和可溶性蛋白等渗透调节物质在盐胁迫时的积累，进而平衡逆境下细胞内外的渗透势，维持细胞的膨压平衡[40]。游离脯氨酸同样作为植物体内抵御逆境的重要有机渗透调节物质之一，对生物大分子的结构与稳定性起一定保护作用[41]。Mujahid等[42]的研究表明经冷等离子体处理的葡萄(Vitisvinifera)芽通过提高游离脯氨酸含量保护细胞结构对抗自由基，并且增加的游离脯氨酸还作为信号分子诱导葡萄芽解除休眠。本研究结果显示在盐胁迫下经中功率(80 W)处理后的Pro含量显著上升，其含量的增加可能减少了细胞结构受自由基的损害[42]，从而表现出植物抗逆性的增强。

丙二醛(MDA)是植物细胞不饱和脂肪酸发生过氧化反应的终产物[43]，反映逆境胁迫对植物细胞膜脂过氧化的伤害程度[44]。赵东晓等[45]的研究表明一定剂量的等离子体辐射能够降低叶片质膜相对透性和MDA含量，进而增强胡麻(Linumusitatissimum)种子抵御NaCl的胁迫。本研究也同样发现，经过冷等离子体处理后的幼苗MDA含量在0.2～0.5 mol·L-1的NaCl胁迫下与CK相比均有不同程度的下降，其原因可能是经冷等离子体处理后的幼苗降低了膜脂过氧化过程中MDA的积累从而降低了植物在盐胁迫时对细胞的损伤程度。SOD，POD和CAT等共同组成植物的抗氧化体系，在逆境胁迫下清除植物体内过量的活性氧，维持细胞膜的稳定性[46]。王佳琪等[47]在研究等离子体对拟南芥幼苗的抗氧化酶系统的影响时发现等离子体处理可以提高萌发后拟南芥(Arabidopsisthaliana)幼苗的抗氧化酶活性。研究指出，抗氧化酶活性的提高与冷等离子体触发植物的瞬时氧化应激有关[42]。本研究也发现在一定浓度盐胁迫下经冷等离子体处理后草地早熟禾幼苗中SOD，POD和CAT的活性均有不同程度的提高，其可能原因是氧化应激反应下抗氧化酶活性的提高维持了活性氧的动态平衡，最终表现为植物对盐胁迫的抗性增强[48]。

此外，本研究用主成分分析对不同功率冷等离子体处理后的草地早熟禾幼苗的抗盐性进行排名后发现经中功率(80 W)处理的抗盐能力优于高功率(120 W)处理，其次为低功率(10 W)处理，但经冷等离子体处理的抗盐能力均高于未经处理的对照CK，该结果表明冷等离子体的处理剂量对植物的抗盐性有直接的影响。张雪等[49]的相关报道指出等离子体的处理效应受处理剂量的直接影响，处理剂量的控制方式一般通过处理时间、处理功率和气流量等。通过改变处理功率研究冷等离子体对植物影响的相关研究中，蒋佳峰等[28]在研究不同功率的冷等离子体对处理过的小麦种子发芽的影响时也得到80 W的处理功率可以显著提高种子的发芽率和生物量。李恺等[36]在研究冷等离子体处理番茄种子对幼苗生长和光能利用的影响时发现75 W的处理功率最佳。因此，特定的冷等离子体处理功率可能因作物种类的不同处理效果也有所差异，但是Ling等[50]的研究指出多数作物在50～150 W的冷等离子体处理后即可提高发芽率，促进萌发后植株生长并提高抗逆性。而本试验中出现低功率(10 W)和高功率(120 W)的处理效果低于中功率(80 W)的原因可能是低功率处理对种子产生的能量跃迁没有达到植株能够抵御逆境胁迫的要求，高功率下被处理的种子受辐射强度大，导致植物部分组织和内部大分子可能会受到损坏，因此在逆境下的生长发育未能达到理想的效果[51]。

4 结论

本研究结果表明冷等离子体种子处理技术可以缓解盐胁迫对萌发后草地早熟禾苗长和根长的影响，显著降低幼苗叶片MDA含量的积累，提高叶绿素、游离脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量以及抗氧化酶(SOD，POD和CAT)活性。将盐胁迫处理后的10个相关指标进行主成分分析，提取到的2个主成分特征值分别为7.238和1.177，累积方差贡献率达到84.154%。依据主成分分析结果计算冷等离子体处理对草地早熟禾幼苗抗盐性的综合得分，结果显示经过不同处理功率对草地早熟禾幼苗抗盐能力的影响排名依次为：中功率(80 W)>高功率(120 W)>低功率(10 W)>CK。