荒漠草原不同放牧强度下土壤酶化学计量特征的研究

李雅男, 李邵宇, 史世斌, 王占海, 张 彬, 陈 恒, 赵萌莉*

(1. 内蒙古农业大学草原与资源环境学院/ 草地资源教育部重点实验室, 内蒙古 呼和浩特 010019； 2. 内蒙古自治区水利科学 研究院， 内蒙古 呼和浩特 010051； 3.呼伦贝尔市农牧技术推广中心， 内蒙古 呼伦贝尔 021008； 4．内蒙古赤峰市克什克腾旗 农牧局， 内蒙古 赤峰 025350)

土壤酶是土壤生物生命活动的产物，作为微生物养分需求的指示器[1]，其活性可以反映土壤生物代谢和物质转化等情况[2]。土壤酶种类繁多，根据存在位置，可将其分为游离酶、胞内酶和胞外酶[3]；根据其反应类型，可分为异构酶、水解酶、转移酶、裂合酶、氧化还原酶和合成酶[4]。碱性磷酸酶(ALP)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)、β-葡萄糖苷酶(βG) 和α葡萄糖苷酶(αG)均属于水解酶，且与土壤碳(C)、氮(N)、磷(P)等营养元素的循环密切相关[4]，通常用其活性来反映土壤微生物代谢速率和生物化学循环过程[5]。环境因子发生变化土壤酶活性也会随之发生显著变化，研究发现海拔高度增加会提高土壤酶活性[6]，土壤酶活性随土壤有机质含量增加而增加[7]；草地利用方式和利用强度是影响土壤酶活性的重要因素，不同刈割强度下羊草草原的土壤酶活性变化规律不尽相同[8]，长期围封会提高高寒草原土壤酶活性[9]，目前，不同放牧强度下，土壤养分转化机理尚无定论，土壤酶活性的变化及其机制亟待探讨。

土壤酶化学计量可表征微生物的养分缺乏情况[10]，全球尺度上，土壤酶化学计量比约为C:N:P=1:1:1，由于气候环境海拔等因素，不同区域的酶化学计量比值会有所偏离，而偏离程度越大说明该地区受该元素限制越严重[11]。Moorhead等[12]通过计算土壤酶化学计量比，碳元素的相对限制量用向量长度表示，氮和磷相对限制量用向量角度表示，以将土壤酶活性与养分的需求比例量化。Sinsabaugh等[11]对全球24个生态系统，41个样地的土壤酶化学计量比整合发现，土壤C:P与温度变化呈显著负相关，温度升高会提高微生物活性和土壤酶活性，提高微生物的代谢速率，进而改变土壤酶化学计量比[13]；温室气体(尤其是CO2)的排放也会通过改变植物根系及根系分泌物，改变活性碳的地下分配格局，增强土壤微生物对C的利用能力，从而改变土壤酶化学计量比[14]；Castor等[15]研究降水对土壤酶化学计量比的影响发现，降水改变了细菌和真菌的相对丰度及群落组成，影响土壤微生物吸收养分的能力，因而改变土壤酶化学计量比。因此，在全球变化背景下研究土壤酶化学计量比，对明确土壤养分循环对其响应机制具有重要意义。

荒漠草原是重要的生态系统，因其植被稀疏、土壤贫瘠，对环境变化较为敏感，成为生态学领域的重要研究对象[16]。放牧是草地利用的重要途径，主要通过家畜的啃食、践踏、排泄行为影响土壤基质、紧实度、容重、含水量、pH和养分循环[17]，其中土壤物理性质对放牧的响应更加剧烈[18]。放牧通过改变土壤基质，对微生物群落产生影响，改变了细菌和真菌的多样性，影响土壤养分循环，进而影响土壤酶活性[19]。目前，不同放牧强度条件下，荒漠草原土壤微生物的养分限制情况及机理尚无定论。本研究依托四子王旗短花针茅(Stipabreviflora)荒漠草原长期放牧平台，分析不同放牧强度下土壤理化性质及其与土壤C、N、P循环密切循环的土壤酶之间的关系，拟回答以下问题：(1) 不同放牧强度下土壤理化性质、酶活性及酶化学计量比如何变化？(2)不同放牧强度下荒漠草原微生物养分限制情况及其驱动机制如何？本研究旨在探究荒漠草原土壤酶在不同放牧强度下的调控机制和适应策略，为荒漠草原合理利用及生态系统修复提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验地位于内蒙古自治区乌兰察布市四子王王府一队(41°46′52″N，111°53′44″E)，该地区海拔约1 450 m，属温带大陆性季风气候，冬季寒冷漫长，夏季炎热期短，最低温度出现在1月，最高温度出现在7月，极端最高气温35.7℃。干旱少雨，年均降水量约为299 mm，且分布极不均匀。建群种为短花针茅(Stipabreviflora)，优势种为无芒隐子草(Cleistogenessongorica)和冷蒿(Artemosiafrigida)，植被盖度较低。土壤为淡栗钙土，土层深约1 m，土体坚硬且透气性较差，有机质含量低，较贫瘠[20]。

1.2 试验设计

试验区于2004年围建，采用围栏放牧的管理方式，长期放牧18年，每年6月开始放牧，10月结束。围栏总面积50 hm2，分为3个大区组，各小区面积基本一致(样地设计见图1)。试验采用随机区组设计，每个区组内设置4个不同放牧强度：重度(Heavy grazing,HG)、中度(Moderate grazing,MG)、轻度放牧区(Light grazing,LG)和对照区(Contral,CK)，共计12个小区，每个小区内载畜率分别为2.71，1.82，0.91，0羊单位·hm-2·半年-1,各小区分别放牧12，8，4，0只羊(蒙古羯羊，体重约60 kg)，每天放牧12小时(6：00—18：00)。

图1 实验小区示意图Fig.1 Diagrammatic illustration of the experimental block

1.3 样品采集

2021年5月于内蒙古四子王旗荒漠草原长期放牧平台进行，因土壤异质性较大[19]，故选取试验区地势平坦的区域，用网格法采集土壤样品。每个小区设置3个10 m×10 m的大样方，样方内间隔2 m收集0～10 cm的表层土壤。样地内12个小区取1 296钻土，6钻合1钻，共计216份土壤样品，每个处理54个重复。将土样过2 mm筛，以剔除植物根系、动物粪便、石块等杂质，充分混合后装入自封袋，放入冰盒带回点实验室待测。测定土壤酶活性的土样于—80℃冰箱保存，测定土壤理化性质的土样风干保存。

1.4 测定项目与方法

表1 测定指标及测定方法[11]Table 1 Measurement indexes and measurement methods

1.5 数据处理与分析

文中将部分数据取对数转化以符合正态分布，酶C∶N∶P通过ln (αG +βG)∶ln(NAG+LAP)∶ln(ALP)计算，公式如下[4]：

土壤C∶N酶活性比=ln(αG+βG)∶ln(NAG+LAP)

(1)

土壤C∶P酶活性比=ln(αG+βG)∶lnALP

(2)

土壤N∶P酶活性比=ln(NAG+LAP)∶lnALP

(3)

根据酶化学计量比假说[11]，采用公式(4)和(5)计算酶化学计量的向量长度(Vector L)和角度(Vector A)[21]

Vector L=SQRT(x2+y2)

(4)

Vector A=DEGREES[ATAN2(x,y)]

(5)

式中：x表示相对C和P获得的酶活性，y表示C和N获得的酶活性，Vector L的长短表示土壤微生物碳限制程度的高低，长度越长，碳的限制越强；Vector A的大小表示土壤微生物氮、磷的限制程度的高低，大于45°表明存在磷限制，小于45°表明存在氮限制，越偏离45°说明限制越严重。

采用单因素(One-Way ANOVE)方差分析比较不同放牧强度下，土壤理化性质、土壤微生物生物量、土壤养分及其化学计量比的变化规律。采用Pearson相关和逐步回归分析检验土壤微生物C,N限制与土壤理化性质、养分及养分化学计量比的关系。使用SPSS (IBM SPSS 23)软件进行ANOVA和Pearson相关分析，小提琴图及相对重要性图使用Origin 2019b (OrginLab 9.0)绘制，土壤C,N限制与其他因子之间的相关关系热图使用R(R Core Team 3.6.3) 绘制。

2 结果与分析

2.1 不同放牧强度土壤理化性质

土壤毛管持水量(CC)、土壤有机碳(SOC)含量、土壤全氮(STN)含量、土壤全磷(STP)含量、土壤可溶性有机碳(DOC)含量、土壤速效磷(SAP)含量、无机氮(Inorganic N)含量以及土壤微生物量(MBC、MBN、MBP)均随放牧强度增加而降低(P<0.05)；土壤容重(SBD)、土壤pH、土壤C∶N、土壤C∶P随放牧强度增加而增加(P<0.05)(图2)。

图2 不同放牧强度土壤理化性质Fig.2 Physicochemical properties of soil with different grazing intensity注：不同字母表示处理间差异显著(P<0.05),下同。CC：土壤毛管持水量，SBD：土壤容重，SOC：土壤有机谈，STN：土壤全氮，STP：土壤全磷，DOC：土壤可溶性有机碳，SAP：土壤速效磷，MBC：土壤微生物量碳，MBN：土壤微生物量氮，MBP：土壤微生物量磷Note：Different letters indicate significant differences between treatments (P<0.05),the same as below. CC:soil capillary water holding capacity,SBD:soil bulk density,SOC:soil organic talk,STN:soil total nitrogen,STP:soil total phosphorus,DOC:soil soluble organic carbon,SAP:soil fast-acting phosphorus,MBC:soil microbial carbon,MBN:soil microbial nitrogen,MBP:soil microbial phosphorus

2.2 不同放牧强度土壤酶活性及其化学计量比

从图3可以看出，与C，N，P相关的5种土壤酶活性均随放牧强度增加而降低，土壤酶活性在CK均显著高于其他放牧强度(P<0.05)。从图4可以看出，土壤酶化学计量比随放牧强度增加变化趋势不一致，随放牧强度增加，土壤C∶N酶化学计量呈上升趋势，土壤C∶P酶化学计量比未发生显著变化，土壤N∶P酶化学计量比呈下降趋势(P<0.05)。

图3 不同载畜率土壤酶活性Fig.3 Enzyme activitie of soils with different stocking rates

图4 不同载畜率土壤酶化学计量比Fig.4 Enzyme stoichiometric ratios of soils with different stocking rates注：ln(αG+βG)/ln(NAG+LAP)：土壤C∶N酶化学计量比，ln(αG+βG)/ln(ALP)：C∶P酶化学计量比，ln(NAG+LAP)/ln(ALP)：N∶P酶化学计量比，下同Note：Soil C∶N enzyme stoichiometry ratio(ln(αG+βG)/ln(NAG+LAP)),C∶P enzyme stoichiometry ratio(ln(αG+βG)/ln(ALP)),N∶P enzyme stoichiometry ratio(ln(NAG+LAP)/ln(ALP)),the same as below

2.3 不同放牧强度土壤养分对微生物的限制

从图5可以看出，所有酶样点都在线下(1∶1线)，且不同放牧强度下向量长度(Vectoe Lengh)和向量角度(Vectoe Angle)均存在显著差异(P<0.05)。随放牧强度增加，Vectoe Lengh和Vectoe Angle均呈现出增加趋势，且不同放牧强度Vectoe Angle值均小于45°，Vectoe Angle最大值出现在HG。根据酶化学计量比假说[11]，样地内土壤微生物受到C限制和N限制。

图5 不同放牧强度下基于酶活性比值的向量长度和角度Fig.5 Vector length and angle based on the ratio of enzyme activity at different stocking rates

2.4 土壤酶活性与环境因子的关系

从图6可以看出，C限制(向量长度)与N限制(向量角度)呈正相关，SOC，MBC，Inorganic N，TN，MBN，MBP均与C限制呈负相关关系，N限制与土壤C∶N，BD和C限制呈正相关关系，与N∶P，CC，SOC，MBC，Inorganic N，DOC，TN，MBN，MBP，TP，SAP均呈负相关关系。

从图7可以看出，土壤理化性质对C限制和N限制的贡献率不同，MBN对C限制的贡献率最大，其次为Inorganic N，MBP，MBC，SOC，pH，TN，N∶P，C∶N，BD，C∶P，CC，DOC，SOC和TP对C限制的贡献率最小，而MBP对N限制的贡献率最大，TN和MBN次之，C∶N，DOC，CC，Inorganic N，N∶P，MBC，TP，C∶P，SOC更小，pH和BD最小(图7)。

图6 土壤酶活性与理化性质的关系Fig.6 Relationship between soil enzyme activity and physicochemical properties注：蓝色圆圈表示两因子间呈负相关关系，红色圆圈表示两因子间呈正相关关系，数字表示相关性大小Note:Blue circles indicate negative correlation between the two factors,red circles indicate positive correlation between the two factors,and numbers indicate the magnitude of correlation

图7 理化性质的相对重要性Fig.7 Relative importance of physical and chemical properties注：图(a)为土壤理化性质对向量长度的相对重要性，图(b)为土壤理化性质对向量角度的相对重要性Note：Figure (a) shows the relative importance of soil physical and chemical properties on vector length,andFigure (b) shows the relative importance of soil physical and chemical properties on vector angle

3 讨论

3.1 放牧对土壤酶活性及其化学计量比的影响

土壤酶可反映土壤微生物代谢和物质转化情况。放牧主要通过影响土壤理化性质、土壤养分、土壤养分化学计量比及土壤微生物生物量影响土壤酶活性。由于放牧家畜的踩踏行为，土壤容重增加(图2)，减小了土壤孔隙度，土壤渗透率较小，导致土壤含水量降低(图2)[22]，进而降低土壤微生物的代谢产酶能力[23]，导致土壤酶活性降低。Martens等[24]研究发现，土壤水解酶活性随土壤容重增加显著降低，随含水量增加显著提高(P<0.05)，与本研究结果一致。家畜通过采食行为改变了草地养分循环，致使土壤养分配比格局发生变化。本研究发现，随放牧强度增强，土壤养分均呈现出不同程度的降低趋势，这是由于放牧会显著减少植物地上生物量、立枯草含量及凋落物的积累，影响养分归还，随着放牧强度的增加，养分向土壤的归还越来越少，故养分含量降低[25]。一方面，养分含量降低导致土壤养分循环速率降低，抑制了土壤酶活性，另一方面，土壤中酶作用底物的扩散由于土壤养分减少受到抑制，因而微生物对养分需求提高，进而土壤酶活性降低[26]。

放牧对土壤C，N，P元素计量比产生了不同程度的影响(图2)，这也可能是酶活性受限制的主要原因之一[27]，王强等[28]在研究施用生物炭对塿土土壤微生物代谢养分限制和碳利用效率的影响中也发现，土壤C，N，P与胞外酶活性和生态酶化学计量的变化存在紧密联系。综上，土壤养分含量直接决定了土壤养分化学计量比，间接限制微生物活性。土壤微生物生物量随放牧强度增加均表现为不同程度的降低(图2)，这可能是由于家畜过度采食导致植物生物量减少导致的[28]，家畜的践踏导致的裸斑裸块面积增加，风蚀作用变强，土壤有机质减少[29]，这也可能引起土壤微生物生物量降低。由于放牧改变了土壤理化性质及养分特征，土壤微生物代谢活性发生改变，进而改变土壤微生物群落结构及其对养分的利用效率[30-31]，继而改变土壤酶活性。

3.2 不同放牧强度下微生物限制及响应机制

根据酶化学计量比假说[11]，向量夹角小于45度(图5)，表明荒漠草原土壤微生物受到C，N限制，且随着放牧强度的增加，C，N限制加重。土壤酶活性与土壤理化性质相关性表明(图6)，驱动微生物C限制和N限制的环境因子并不相同。其中，对C限制贡献率最大的环境因子是MBN(图7)。基于酶资源分配理论，微生物根据其获取养分的多少改变其生存策略，当养分充足时增加酶分泌，养分匮乏时减少酶分泌[32]，MBN的含量随放牧强度增加显著降低，与N相关的酶活性降低，系统将投入更多的养分平衡N素的缺失，导致与C相关酶可利用养分减少，造成微生物受C限制。此外，微生物受C限制的原因还可能是放牧动物的采食降低了群落地上、地下生产力，进而影响养分循环速率[33]，微生物活性降低。长期放牧减少凋落物的累积，其向土壤返还的养分减少[34]，影响土壤对植物根系的养分供给，土壤养分的有效性会随根系对养分竞争的加剧而降低，阻碍微生物获取养分[35]。此外，也可能由于根系沉积减少了C源，进而增加了微生物C限制[36]。

土壤中N含量及C∶N是造成土壤微生物受到N限制的两个重要原因。养分与土壤酶活性具有趋同性[37]，土壤养分可以通过调节酶的分泌改变土壤酶活性，同时，土壤养分含量发生变化会改变土壤酶的生化特性，这也会使土壤酶活性发生变化[29]，土壤中N含量随放牧强度增加显著降低，不能为与N相关的酶提供充足的反应底物，故土壤酶活性降低，引起微生物受到N限制。土壤养分化学计量比可以表征土壤养分供给能力[33]，当C∶N较高时,表明土壤中N素相对充足,充足的N含量可以满足微生物的生长和新陈代谢,而土壤C∶N较低时,用于微生物代谢的N素就会释放到土壤中[38]。已有研究表明，土壤有机质分解速率随土壤C∶N增加而降低[38]，土壤C∶N与放牧强度呈负相关关系，在重度放牧条件下，土壤有机质分解速率最低，土壤N素含量逐渐匮乏[39]。养分化学计量比变化导致土壤养分供应的不平衡，进而导致微生物的养分限制[34]。此外，放牧家畜的践踏作用增加了土壤容重，降低了土壤含水量，限制了微生物活性[40]，这也可能是导致微生物受N限制的原因。

4 结论

随载畜率增加，与C(αG,βG)、N(NAG,LAP)、P(ALP)相关的5种酶活性均降低，土壤C∶N酶化学计量增加(P<0.05)，土壤C∶P酶化学计量比未发生显著变化，土壤N∶P酶化学计量比降低。荒漠草原受C，N限制，驱动C限制的主要因子为MBN，驱动N限制的主要因子为MBP，且放牧强度越强，养分限制越严重。放牧主要通过影响土壤理化性质及养分含量影响微生物化学计量，因此，适当加入C，N元素有助于退化荒漠草原的修复。