基于p38MAPK/NF-κB信号通路的穴位埋线对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜上皮屏障的影响

谢超群，邹君君，张建伟，朱莹

1.湖南中医药大学研究生院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005；3.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种以腹痛、腹泻及血便为主要临床表现的慢性非特异性肠道炎症性疾病，主要病理特点是肠道炎症和溃疡形成，病情迁延难愈。其发病机制尚未阐明，但有研究表明，肠黏膜屏障功能损伤是UC发病的关键环节。紧密连接及相关蛋白，如闭锁小带蛋白-1（ZO-1）、咬合蛋白（Occludin）在维持完整的肠上皮屏障方面至关重要，其功能缺陷导致肠黏膜通透性增加。p38MAPK/NF-κB信号通路可介导肠黏膜屏障炎症反应，改变紧密连接的结构和功能，进而影响肠黏膜上皮屏障功能。目前西医主要以氨基水杨酸类、糖皮质激素类、免疫抑制剂等药物治疗为主，短期内可控制和缓解症状，但停药后易复发，长期用药不良反应多。因此，寻找安全有效的治疗方法具有重要意义。研究显示，穴位埋线治疗UC疗效确切，具有抑制自身免疫反应，控制或减轻炎症作用。课题组前期研究表明，穴位埋线能有效缓解炎症，改善肠道黏膜损伤。本研究以p38MAPK/NF-κB信号通路对肠黏膜上皮屏障的调控作用为切入点，探讨穴位埋线对UC大鼠的治疗作用及效应机制，以期为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级SD 雄性大鼠46 只，2～3 月龄，体质量（200±20）g，由湖南中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号SCXK（湘）2019-0004。饲养于温度（23±2）℃、湿度50%～70%环境。自由摄食饮水，适应性喂养1周。

1.2 主要试剂与仪器

腺嘌呤，上海源叶生物科技有限公司，批号S09S10D97125；2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS），美国Sigma 公司，批号SLCG2384；柳氮磺吡啶（SASP）肠溶片，上海信谊天平药业有限公司，批号09 190501；番泻叶，湖南中医药大学第二附属医院，批号 200401；β-actin、Occludin、ZO-1、p38 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子（NF）-κB p65抗体，武汉赛维尔生物科技有限公司，货号分别为GB12001、GB11149、GB111402、GB13490、GB11142；白 细 胞 介 素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α ELISA试剂盒，上海酶联生物工程有限公司，货号分别为ml037361、ml102828、ml002859。7号一次性埋线针，山东博达医疗用品股份有限公司，批号20 200515；4-0可吸收胶原蛋白线，山东博达医疗用品股份有限公司，批号BD 200801；电泳仪，北京六一仪器厂，型号DYCZ-24DN；快速转膜仪，北京六一仪器厂，型号DYCZ-40DN；多功能酶标仪，深圳市汇松科技发展有限公司，型号MB-530；超微量分光光度计，美国Thermo，型号NanoDrop2000；荧光定量PCR仪，美国ABI，型号7300；匀浆仪，武汉赛维尔，型号KZ-Ⅱ；病理切片机，德国徕卡，RM2016。

1.3 造模及分组

采用随机数字表法将46 只大鼠随机分为空白组（10只）和造模组（36只），参考前期方法造模，造模组先予腺嘌呤10 mL/kg灌胃2周，再以番泻叶水提液10 mL/kg灌胃2周，空白组予等量生理盐水灌胃，连续4周。第29日大鼠禁食不禁水24 h，10%水合氯醛腹腔注射（4 mL/kg）麻醉后，按100 mg/kg 予5%TNBS（50 mg/mL）＋50%乙醇0.25 mL制成的混合试剂灌肠，捏紧大鼠肛门并提起大鼠尾部，保持大鼠头部朝下倒立2 min，放回鼠笼，待其自然清醒，自由摄食饮水。造模结束后，随机选取造模组与空白组各3只大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，腹主动脉取血及结肠组织，进行血液流变学检测、ELISA检测、HE染色以验证造模是否成功。造模组HE染色显示结肠组织炎性浸润、出血，血清游离三碘甲腺原氨酸、游离甲状腺素、睾丸酮、皮质醇含量降低，血黏度升高，IL-6、IL-8、TNF-α含量增加，提示造模成功。将剩余33只大鼠随机分为模型组、SASP组及埋线组，每组11只。

1.4 干预

造模后第3日进行干预，埋线组参考《实验针灸学》，选取“足三里”“天枢”“大肠俞”“脾俞”“肾俞”“膈俞”埋线。选穴定位后备皮，络合碘消毒，使用一次性埋线针将0.5 cm羊肠线埋入相应穴位，确保线头不外露，操作完成后在对应皮肤处覆盖无菌敷料，穴位埋线每14 d 1 次，共操作3 次；SASP 组予SASP混悬液灌胃（50 mg/kg），灌胃体积5 mL/kg，埋线组、空白组、模型组予等量生理盐水灌胃，连续42 d。

1.5 一般情况观察

实验过程中每日记录大鼠体质量、饮食饮水情况，对大鼠精神状况、毛发光泽度、大便性状等进行观察。

1.6 结肠黏膜损伤指数评分

干预结束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，暴露腹腔，取距肛门6～10 cm结肠段，进行结肠黏膜损伤指数（CMDI）评分。无损伤0分；黏膜充血、水肿，未出现溃疡1分；黏膜充血、水肿、轻度糜烂，无溃疡2分；黏膜充血、水肿、中度糜烂，有单个溃疡3分；黏膜充血、水肿、高度糜烂，有多处溃疡4分；黏膜充血、水肿、重度糜烂，有＞1 cm溃疡5分。

1.7 结肠长度测量

取大鼠回盲部至肛门结肠，测量长度。

1.8 HE染色

取距肛门6～10 cm结肠，置于4%多聚甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，封片，显微镜下观察结肠组织病理变化。

1.9 ELISA检测

腹主动脉取血后，静置1 h，4 ℃、3 500 r/min离心10 min，吸取血清，按照ELISA试剂盒说明书检测TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.10 PCR检测

取距肛门6～10 cm结肠（约25 mg），Trizol法提取总RNA，以总RNA 为模板，反转录为cDNA，以cDNA为模板进行RT-PCR。扩增条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃循环15 s，60 ℃循环30 s，共40个循环。引物序列见表1。以GAPDH为内参，采用2法计算目的基因相对表达量。

表1 各基因PCR引物序列

1.11 Western blot检测

取约0.02 g结肠组织研磨成匀浆，加入RIPA裂解液，4℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液，BCA法检测蛋白浓度。电泳，转膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入p38MAPK一抗（1∶1 000）、NF-κB p65一抗（1∶5 000）、Occludin 一抗（1∶1 000）、ZO-1一抗（1∶1 000）、β-actin一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，加入二抗（1∶5 000），室温孵育2 h；PBST清洗3次，每次10 min；滴加ECL发光液曝光，采用Image J软件对蛋白条带进行灰度分析，以目的蛋白与内参蛋白灰度值比值计算目的蛋白相对表达量。

1.12 统计学方法

2 结果

2.1 穴位埋线对模型大鼠一般情况的影响

空白组大鼠精神及活动度均良好，反应灵敏，毛发光泽，体质量增加，粪便成形，无稀便及血便；模型组大鼠蜷卧嗜睡，反应迟钝，毛发粗糙散乱、晦黯无光泽，饮食减少，体质量明显减轻，并伴有不同程度腹泻、黏液脓血便；SASP组和埋线组大鼠症状、体征均有不同程度改善。与空白组比较，模型组大鼠体质量显著减轻（＜0.01）；与模型组比较，SASP组和埋线组大鼠体质量显著增加（＜0.01）。见图1。

图1 各组大鼠体质量比较（，每组6～7只）

2.2 穴位埋线对模型大鼠结肠黏膜损伤指数评分的影响

空白组大鼠结肠黏膜光滑粉嫩，未见明显异常；模型组大鼠结肠黏膜颜色偏黯，充血水肿明显，肠腔内可见多处溃疡灶；SASP组和埋线组大鼠结肠黏膜充血水肿较轻，少数肠壁可见糜烂及小溃疡灶。与空白组比较，模型组大鼠CMDI评分显著升高（＜0.01）；与模型组比较，SASP组和埋线组大鼠CMDI评分显著降低（＜0.01）。见表2、图2。

图2 各组大鼠结肠形态

表2 各组大鼠CMDI评分比较（，分）

2.3 穴位埋线对模型大鼠结肠长度的影响

与空白组比较，模型组大鼠结肠长度显著减少（＜0.01）；与模型组比较，SASP组及埋线组大鼠结肠长度显著增加（＜0.01）。见图3。

图3 各组大鼠结肠长度比较（，每组6～7只）

2.4 穴位埋线对模型大鼠结肠组织病理形态的影响

空白组大鼠结肠组织结构完整，无充血水肿、溃疡等异常；模型组大鼠结肠组织局部溃疡，结构模糊，腺体破坏、排列紊乱，有充血及水肿，可见大量炎性细胞浸润，各层分界不清；SASP组及埋线组大鼠结肠黏膜病变明显缓解，可见溃疡面恢复，有肉芽组织增生，腺体排列较连续，炎性浸润减轻。见图4。

图4 各组大鼠结肠组织形态（HE染色，×200）

2.5 穴位埋线对模型大鼠血清炎症因子含量的影响

与空白组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量显著增加（＜0.01）；与模型组比较，SASP组及埋线组大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量显著减少（＜0.01）。见图5。

图5 各组大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量比较（，每组6～7只）

2.6 穴位埋线对模型大鼠结肠组织p38MAPK、NF-κB p65、Occludin和ZO-1 mRNA表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠结肠组织p38MAPK、NF-κB p65 mRNA 表达显著升高，Occludin、ZO-1 mRNA表达显著降低，差异有统计学意义（＜0.01）；与模型组比较，SASP 组及埋线组大鼠结肠组织p38MAPK、NF-κB p65 mRNA 表 达 显 著 降 低，Occludin、ZO-1 mRNA表达显著升高，差异有统计学意义（＜0.05，＜0.01）。见图6。

图6 各组大鼠结肠组织p38MAPK、NF-κB p65、Occludin和ZO-1 mRNA表达比较（，每组6～7只）

2.7 穴位埋线对模型大鼠结肠组织p38MAPK、NF-κB p65、Occludin和ZO-1蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠结肠组织p38MAPK、NF-κB p65蛋白表达显著升高，Occludin、ZO-1蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（＜0.01）；与模型组比较，SASP 组及埋线组大鼠结肠组织p38MAPK、NF-κB p65蛋白表达显著降低，Occludin、ZO-1蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（＜0.05，＜0.01）。见图7、图8。

图7 各组大鼠结肠组织p38MAPK、NF-κB p65、Occludin和ZO-1蛋白表达比较（，每组6～7只）

图8 各组大鼠结肠组织p38MAPK、NF-κB p65、Occludin和ZO-1蛋白免疫印迹

3 讨论

UC是一种累及结直肠的弥漫性炎症性疾病，肠黏膜上皮屏障紧密连接缺陷是重要致病因素。穴位埋线是将羊肠线植入相应穴位，起到持续刺激作用，从而达到“深纳而久留之，以治顽疾”之效。中医认为本病病位在肠，涉及脾肾之脏，病机属本虚标实，即脾肾阳虚为本，血瘀为标。本研究在经穴-脏腑相关理论及临证经验的指导下，取“足三里”“天枢”“大肠俞”“脾俞”“肾俞”“膈俞”埋线治疗。足三里为足阳明经合穴、胃之下合穴，《四总穴歌》云“肚腹三里留”，其在治疗胃肠疾病中发挥重要作用；天枢为大肠募穴，凡属六腑之病症皆可取位于胸腹部腹募穴治疗；两者合取远近配穴之义，可达健脾止泻之效；脾俞、肾俞、大肠俞为背俞穴，功善温阳，脾肾阳虚为发病之本，此三者共达调整脏腑虚实、扶正补虚之效；膈俞为八会穴之血会，主活血化瘀生新。六穴合用，共奏温阳止泻、活血化瘀之功。本研究结果显示，穴位埋线可明显改善UC大鼠体质量、CMDI评分及结肠组织病理损伤，对“虚、瘀”状态下UC大鼠具有明显的保护作用。

紧密连接是肠上皮屏障的重要组成部分，其完整性和稳定性是肠道发挥屏障功能的基础Occludin是构成紧密连接的重要跨膜蛋白，负责调控紧密连接稳定性和通透性，并与ZO-1形成紧密连接的基本结构。ZO-1是一种外周膜蛋白，其C端可与Occludin、actin等结合，在Occludin与actin细胞骨架之间形成稳定的连接复合物，从而维持紧密连接稳定，阻止有害物质和病原体进入。研究表明，UC大鼠肠黏膜组织Occludin、ZO-1蛋白表达显著降低，肠黏膜通透性增加，是导致UC炎症反应的主要因素。本实验中模型组大鼠结肠组织局部溃疡，腺体破坏，有充血及水肿，可见大量炎性细胞浸润，Occludin、ZO-1表达明显降低；经穴位埋线干预后，大鼠结肠黏膜病变缓解，溃疡面恢复，炎性浸润减轻，Occludin、ZO-1表达明显升高，提示穴位埋线具有维护紧密连接完整性和稳定性、降低肠黏膜通透性、修复肠黏膜上皮屏障的作用。

p38MAPK是MAPK家族的成员，通过酪氨酸和苏氨酸双磷酸化激活后，参与炎症因子NF-κB、TNF-α等的调控，与炎症因子形成正反馈调节，加剧肠道炎症反应，引起紧密连接断裂，肠黏膜屏障损伤，增加肠黏膜通透性。NF-κB作为与炎症反应密切相关的转录激活因子，可被p38MAPK磷酸化后的特异性底物激活，是p38MAPK通路下游的重要因子，在真核生物结肠上皮细胞中以p65和p50组成的异二聚体存在，其中p65是NF-κB最常见的活性形式。正常状态下，NF-κB处于未激活状态，当受到炎症信号刺激时，刺激信号依赖NF-κB抑制因子（IκB）激酶降解IκBs，进而活化NF-κB通路，释放IL-6、IL-1β、TNF-α等炎症因子，NF-κB p65又与促炎因子相互作用，形成正反馈调节，进而扩大炎症反应，加剧肠黏膜屏障破坏。本研究结果显示，穴位埋线通过抑制p38MAPK/NF-κB信号通路激活，减少炎症因子释放，提高Occludin、ZO-1表达，修复紧密连接，进而维护肠黏膜上皮屏障功能。

综上所述，穴位埋线能有效缓解UC大鼠结肠黏膜炎症反应，修复肠黏膜上皮屏障，发挥治疗UC的作用。其作用可能是通过抑制p38MAPK/NF-κB通路激活，上调紧密连接蛋白表达，维护肠上皮紧密连接完整性和稳定性，降低肠黏膜通透性实现。