基于Keap1/Nrf2信号通路的红芪多糖对糖尿病胃轻瘫大鼠氧化损伤的影响

郭倩，李雅琪，万生芳，魏昭晖，王同亮，李荣科，张磊，舒畅，李亚玲，杨雅丽

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.中国药科大学，江苏 南京211298

糖尿病胃轻瘫（diabetic gastroparesis，DGP）是糖尿病（diabetes mellitus）常见的慢性并发症，可见于60%以上糖尿病患者。DGP发病机制复杂，与自主神经病变、胃肠激素紊乱、胃组织细胞病变、高血糖、氧化应激等因素密切相关。DGP属中医学“痞满”“呕吐”“反胃”等范畴，主要由脾气虚弱，脾失转运，营气化生无源所致，治疗以补益脾气为主。红芪是甘肃道地药材，具有补气健脾、生津养血等功效，红芪多糖是其主要活性成分，具有调节机体细胞免疫、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老等作用。课题组前期研究发现，红芪多糖能够降低DGP大鼠血糖，促进胃动力、胃排空及胃激素分泌，保护和修复胃平滑肌细胞及胃黏膜损伤，上调小肠组织c-Kit、Cx43基因和蛋白表达。基于前期研究，本实验观察DGP大鼠小肠组织肌电活动，结合氧化应激相关指标检测，进一步探讨红芪多糖促进肠动力、抑制氧化损伤的机制，为指导其临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 动物

SPF 级雄性Wistar 大鼠，8 周龄，体质量180～200 g，甘肃中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK（甘）2015-0002。饲养于甘肃中医药大学SPF级实验室，温度23 ℃、相对湿度50%环境。本实验经甘肃中医药大学实验动物中心动物伦理委员会审批（2020-041）。

1.2 药物

红芪多糖，宝鸡市方晟生物开发公司，纯度72.4%，批号20200315，临用前用纯净水溶解，制成浓度分别为12、6、3 mg/mL溶液。枸橼酸莫沙必利分散片，批号190614，成都康弘药业集团股份有限公司，5 mg/片，将药品粉碎，用纯净水溶解，制成浓度为0.35 mg/mL溶液。

1.3 主要试剂与仪器

水合氯醛，天津市大茂化学试剂厂，批号20 190504；链脲佐菌素（STZ），美国VETEC 公司，批号WXBD0304V；活性氧（ROS）试剂盒，江苏酶标生物，批号MB-6608A；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、8-羟基脱氧鸟苷酸（8-OHdG）、丙二醛（MDA）试剂盒，上海酶联生物，批号分别为ml059387、ml097316、ml028318、ml 077384；Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）抗体、核因子E2相关因子（Nrf2）抗体、血红素加氧酶-1（HO-1）抗体，英国Abcam 公司，批号分别为ab139729、ab92946、ab68477；硫氧还蛋白（Trx）抗体，美国Affinity公司，批号DF7621；血糖试纸，罗氏血糖健康医护公司，批号 478151；β-actin一抗，美国Affinity公司，批号AF-7018-100；辣根过氧化物酶标记二抗，美国Affinity公司，批号S0001；DAB显色液，北京中杉金桥生物技术有限公司，批号PV-6000D；Super ECL Plus超敏发光液，北京普利莱基因科技有限公司，批号P10100。ML408 生物电放大器（澳大利亚ADInstruments），PL3508生理信号采集系统（澳大利亚ADInstruments），Accu-Chek Performa型血糖仪（瑞士罗氏），XYJ80-2电动离心机（常州市金坛恒丰仪器厂），Infinite M200 Pro多功能酶标仪（瑞士Tecan），电泳仪、转膜仪（美国Bio-Rad 公司），AUW220D 半微量电子天平（日本岛津公司），FRESCO 21 高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.4 造模、分组及给药

将72 只大鼠适应性饲养1 周后随机分为空白组12只和造模组60只。禁食不禁水12 h，造模组大鼠按55 mg/kg一次性腹腔注射1%STZ溶液（0.1 mmol/L柠檬酸钠缓冲液配制），空白组大鼠注射等体积0.1 mmol/L柠檬酸钠缓冲液。72 h后尾静脉采血，测定随机血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病大鼠。糖尿病大鼠以高糖高脂饲料不规则喂养（单日上午进食，双日下午进食），连续4周，测定血糖≥16.7 mmol/L，并伴有饮水量增加、腹部胀大、体质量明显减轻等表现，随机抽取空白组与造模组各2只大鼠检测小肠肌电活动，造模组大鼠较空白组小肠自主收缩频率显著降低，提示造模成功。根据实际成模大鼠数量并综合考虑模型大鼠死亡率，将成模大鼠随机分为模型组11只，阳性药组和红芪多糖高、中、低剂量组各10只，另设空白组10只，空白组予普通饲料喂养，其余各组继续高糖高脂饲料喂养。按照人与大鼠体表面积换算给药剂量，阳性药组予枸橼酸莫沙必利溶液3.5 mg/kg灌胃，红芪多糖高、中、低剂量组分别予红芪多糖溶液0.12、0.06、0.03 g/kg灌胃，灌胃体积2 mL/只，空白组和模型组灌胃等体积纯净水，连续8周。

1.5 小肠肌电活动检测

实验前大鼠禁食24 h、禁水2 h，腹腔注射10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）麻醉，有齿镊刺激大鼠四肢，无疼痛反射且角膜反射存在时开始实验。大鼠仰卧位固定于恒温解剖台，腹部备皮，常规消毒。剑突下沿上腹正中线剖开，切口2～4 cm，暴露小肠，于距离回盲部约2 cm处回肠上置入银针电极，测量电极置于肠壁浆肌层（电极直径0.3 mm，回盲部交界处接正极，向左旁开约0.3 cm处胃体接负极），参考电极夹于大鼠皮下，电极输入端与生物机能实验系统连接，进行信号采集。实验参数：采样率1 k/s，量程20 mV，低通20 Hz，高通0.3 Hz，50 Hz陷波为开，电源滤波器为开。检测过程中肠管上方覆盖温生理盐水纱布以减少体温流失，并关注大鼠麻醉状态，若出现头部等活动或四肢收缩，则适量追加麻醉，使大鼠处于平稳麻醉状态，便于观察。波形平稳后，连续记录60～80 min，以5 min为一个时间段，每个数据样本截取基线平稳的波形，随机截取6个时间段，计算大鼠各时间段小肠组织肌电慢波频率和振幅，取其平均值，采用Lab Chart8 Reader软件读取分析。

1.6 ELISA检测

给药结束后大鼠禁食24 h、禁水2 h，10%水合氯醛腹腔注射（0.33 mL/100 g）麻醉，分离小肠组织，剪取100 mg小肠组织于玻璃匀浆器中，加入1 mL生理盐水，冰浴条件下匀浆，4 ℃、4 000 r/min离心10 min，吸取上清液，采用ELISA检测小肠组织ROS、SOD、GSH-Px、8-OHdG和MDA水平。

1.7 Western blot检测

剪取约100 mg小肠组织，加入1 mL RIPA裂解液，冰上充分研磨，匀浆4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液，采用BCA法测定蛋白浓度，加入5×上样缓冲液，充分混匀后，100 ℃水浴加热10 min，冷却至室温后再次离心5 min，取上清液上样，5%浓缩胶与10%分离胶进行电泳。冰浴、200 mA转膜60 min，将蛋白转至PVDF膜，加入5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST 洗涤3 次，滴加Keap1 一抗（1∶1 000）、Nrf2一抗（1∶1 000）、Trx一抗（1∶1 000）、HO-1一抗（1∶10 000）、β-actin一抗（1∶10 000），4 ℃孵育过夜。次日取出条带，TBST清涤3次，滴加二抗（1∶5 000），室温孵育2 h。ECL 发光液显影，采用凝胶成像分析仪采集图像，Image J 软件分析蛋白灰度值，以目的蛋白与内参蛋白灰度值比值计算蛋白相对表达量。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 红芪多糖对模型大鼠小肠组织肌电活动的影响

与空白组比较，模型组大鼠小肠组织肌电慢波频率和振幅明显降低，差异有统计学意义（＜0.01）；与模型组比较，阳性药组和红芪多糖高、中剂量组大鼠小肠组织肌电慢波频率和振幅明显升高，差异有统计学意义（＜0.01）。见表1、图1。

图1 各组大鼠小肠组织肌电活动

表1 各组大鼠小肠组织肌电慢波频率和振幅比较（）

2.2 红芪多糖对模型大鼠小肠组织活性氧、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、8-羟基脱氧鸟苷酸、丙二醛水平的影响

与空白组比较，模型组大鼠小肠组织ROS、8-OHdG、MDA水平明显升高，SOD、GSH-Px水平明显降低（＜0.01）；与模型组比较，阳性药组和红芪多糖高、中剂量组大鼠小肠组织ROS、8-OHdG、MDA水平明显降低，SOD、GSH-Px 水平明显升高（＜0.05，＜0.01）。结果见表2。

表2 各组大鼠小肠组织ROS、SOD、GSH-Px、8-OHdG、MDA水平比较（，ng/mL）

2.3 红芪多糖对模型大鼠小肠组织Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1、核因子E2相关因子、血红素加氧酶-1、硫氧还蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠小肠组织Keap1蛋白表达明显升高，Nrf2、HO-1、Trx蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（＜0.01）；与模型组比较，阳性药组和红芪多糖高、中剂量组大鼠小肠组织Keap1蛋白表达明显降低，Nrf2、HO-1、Trx蛋白表达明显升高，差异均有统计学意义（＜0.05，＜0.01）。见图2、表3。

表3 各组大鼠小肠组织Keap1、Nrf2、HO-1、Trx蛋白表达比较（）

图2 各组大鼠小肠组织Keap1、Nrf2、HO-1、Trx蛋白免疫印迹

3 讨论

DGP是糖尿病常见慢性并发症，我国糖尿病患病率人数高居全球首位，其中有5年以上糖尿病病史的患者中，有超过一半患者存在胃轻瘫症状，临床表现多为餐后饱胀、厌食、腹胀、呕恶等，严重影响患者生活质量。中医学认为，消渴日久，损伤脾气，脾气虚则升降功能失调，转运失常。其根本病机为脾气虚弱，失于健运，治当补气健脾。红芪为补气之要药，其重要组分红芪多糖可以改善胰岛素抵抗，阻止或延缓2型糖尿病并发症。研究表明，红芪多糖通过增加Nrf2表达影响抗氧化酶类表达，从而调控氧化应激反应，改善糖尿病心肌病小鼠心肌损伤；通过上调Bcl-2/Bax表达，抑制脾虚型糖尿病大鼠胃窦组织胃黏膜细胞凋亡。

氧化应激是机体氧化和抗氧化失衡引起ROS 异常增多的一种病理表现，是心血管和代谢疾病的主要致病因素，也是影响DGP 的重要因素之一。8-OHdG、MDA、SOD和GSH-Px 是衡量机体氧化应激水平的常用指标。高血糖可使ROS异常增多，氧自由基增加，机体抗氧化能力降低，代谢失常。SOD、GSH-Px是体内重要的抗氧化酶，可反映机体的抗氧化水平，有效清除氧自由基，维持机体氧化平衡。研究表明，抑制氧化酶表达能提高ROS和MDA含量，引起氧化应激。而氧化应激参与DGP的发生发展，是DGP发病的重要机制。

Keap1/Nrf2信号通路是抗氧化应激的经典信号通路，Keap1是氧化还原反应的传感器，通过氧化还原反应使构象发生变化从而使Nrf2解离，转入细胞核内与Maf蛋白结合成异质二聚体后与抗氧化反应元件结合，激活调控Ⅱ相代谢酶、抗氧化酶或药物转运体的转录活性，发挥抗氧化损伤作用，恢复细胞内稳态。Keap1是氧化应激的关键蛋白，能提高机体对心肌微血管内皮细胞的保护作用，协调氧化应激，缓解机体氧化损伤。Nrf2是该信号通路中重要的细胞保护性转录因子。当机体发生氧化应激时，Nrf2与Keap1解偶联，活化的Nrf2转运进入细胞核，与抗氧化反应元件结合，激活下游抗氧化酶如HO-1、Trx等表达并诱导下游抗氧化酶如SOD、GSH-Px基因转录，从而保护细胞免受ROS 导致的损伤。HO-1 和Trx 是Keap1/Nrf2 信号通路激活的重要抗氧化酶，能够清除过量ROS，维持细胞氧化/抗氧化平衡。因此，HO-1和Trx的活性对减轻机体氧化应激程度，维持氧化平衡状态有重要意义。

本实验中模型组大鼠小肠组织Keap1蛋白表达显著升高，Nrf2、HO-1、Trx蛋白表达显著降低，ROS、8-OHdG及MDA水平显著升高，SOD和GSH-Px水平显著降低，这可能是导致DGP大鼠小肠肌电活动慢波频率与振幅降低、出现氧化应激损伤的原因之一。经药物干预后，阳性药组和红芪多糖高、中剂量组大鼠小肠组织Keap1蛋白表达显著降低，Nrf2、HO-1、Trx蛋白表达显著升高，ROS、8-OHdG及MDA水平显著降低，SOD和GSH-Px水平显著升高，小肠肌电活动慢波频率与振幅显著升高，提示机体抗氧化应激能力明显改善。

综上，红芪多糖能改善DGP大鼠小肠动力，其机制与上调氧化应激关键蛋白Nrf2、HO-1、Trx 表达，下调Keap1蛋白表达，降低ROS、8-OHdG及MDA水平，升高SOD和GSH-Px水平有关。本结果为课题组进一步探讨红芪多糖治疗DGP胃肠动力障碍的机制提供实验依据，也为中药治疗DGP 提供新思路、新方法。