间充质干细胞外泌体对MPTP诱导急性帕金森小鼠模型的治疗作用

帕金森病(Parkinson's disease, PD)是中老年人常见的中枢神经系统变性疾病。其主要病理改变为中脑黑质致密部多巴胺(dopamine,DA)能神经元进行性变性丢失，纹状体区多巴胺含量减少,以及残存的多巴胺能神经元内形成以突触共核蛋白(α-Synuclein, α-Syn)为主要成分的嗜酸性包涵体—路易小体(Lewy body, LB)。

帕金森疾病的治疗目前仍无显著有效的药物，干细胞治疗是诸多方法中很有前景的一种，尤其是间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)。间充质干细胞是一种多功能性细胞，表现出低免疫原性，具有多向分化的同时，还具有免疫调节的生物学潜能，可以离体扩大培养

，根据文献，其对神经系统疾病有一定的治疗作用

。现阶段研究发现，MSC的治疗作用主要来源于间充质干细胞旁分泌作用产生的外泌体(exosomes，Exo)和可溶性因子，其中外泌体中含有microRNA、蛋白质在内的多种物质，可以发挥靶向调节作用

，其能够通过血脑屏障

，在治疗神经疾病方面更有优势。文献显示，间充质干细胞来源的外泌体(mesenchymal stem cells-derived exosomes, MSC-Exo)能够到达黑质，显著抑制6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)诱导的PD大鼠疾病模型

，能够抑制PD小鼠模型的氧化应激

。本文探讨通过尾静脉注射MSC-Exo对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3, 6-tetrahydropyridine, MPTP)诱导的急性帕金森小鼠模型的治疗作用，从神经元损失到炎性变化以及氧化应激等多方面观察效果。

1 材料与方法

1.1 实验材料 从西安交通大学实验动物中心购买8～12周的C57BL/6小鼠，适应性饲养一周后进行实验，期间自由饮食饮水，12h∶12h昼夜环境。

1.2 间充质干细胞外泌体的提取鉴定 取小鼠皮下脂肪，剪碎后，用0.1%胶原酶Ⅰ 37℃消化40min，然后 200目滤网过滤后，1000rpm，5min离心，培养液悬浮后，接种培养瓶，培养液为改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium,DMEM)+10%优级胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)

。培养至4到6代时，在细胞长至融合后，更换为无血清DMEM，继续培养24h，收集上清提取外泌体。首先以300g，10min离心去除细胞以及碎片等，然后取上清2000g，10min离心去除较小的细胞碎片，接着以10000g，30min离心清除凋亡体，最后100000g，70min超速离心沉淀外泌体，所有离心步骤均为4℃处理，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)重悬外泌体后-80℃保存。采用BCA(bicinchoninic acid)法对外泌体进行定量，免疫印迹法检测外泌体标志分子CD63 (1∶1000, Abcam, California, USA)和CD81 (1∶1000, Abcam, California, USA)的表达。

1.3 MPTP诱导小鼠帕金森模型 将45只小鼠分为3组，分别为Sham组、PD组和PD+MSC-Exo组，每组15只，Sham组在造模时给予生理盐水，PD组腹腔注射MPTP诱导急性PD模型，PD+MSC-Exo组在PD造模后尾静脉注射给予MSC-Exo。用MPTP(M2690, Tokyo Chemical IndustryTCI，日本)诱导小鼠急性帕金森模型，MPTP用生理盐水溶解，配成2mg/ml试剂，小鼠连续腹腔注射4次MPTP，间隔2h，每次按照20mg/kg给药，总剂量是80mg/kg

。2h后，尾静脉给予MSC-Exo，每只50ug/150ul

。在第4天，14天，30天时取材。

自从有了小弟，我们家增添了许多欢声笑语。我喜欢给他喂饭，看他一口接一口香香地吃着，心里美滋滋的。我喜欢和他一起洗澡，看他笨手笨脚去爬海洋球的池子，可爱极了！我喜欢和他一起玩滑滑梯，看他从滑梯上滑下来那股高兴劲儿，我比他还要开心！也不知道为什么会这样，大概跟他在一起时，我也觉得自己变小了、可以无忧无虑了吧。

本文实验中用MPTP成功诱发急性帕金森模型，实验发现，C57BL/6小鼠给予MPTP连续4次后(2h一次，每次20mg/kg)，小鼠的神经元显著减少，TH表达降低，给阿朴吗啡后，PD小鼠的转圈数达到200多以上，出现典型的帕金森症状，同时发现，PD小鼠给予MSC-Exo后症状显著缓解，转圈数相比PD组显著下降，并且神经元损失减少，TH的表达量也明显上升，表明MSC-Exo对帕金森的治疗具有显著作用，能够保护神经元，改善行为学特性。另外，我们还发现PD小鼠纹状体的炎症因子TNFα、IL-1β和氧化应激分子Nrf2、Keap1的表达显著高于Sham组，给予MSC-Exo后小鼠的这些因子表达显著下降。我们的结果与文献报道的结果一致，有临床试验用自体脂肪MSC治疗帕金森病人，发现对运动障碍有一定的治疗效果

，给PD大鼠移植MSC同样能够显著减少转圈数，增加TH的表达

，关于MSC-Exo对PD治疗效果的研究目前较少，Chen等

发现Exos在体内通过血脑屏障到达黑质，能够缓解PD小鼠中阿朴吗啡诱导的不对称旋转，减少黑质多巴胺能神经元的丢失和凋亡，并上调纹状体多巴胺水平，Ma等

发现在PD小鼠中，骨髓间充质干细胞的Exo通过携带miR-181a-2-3p减轻多巴胺神经元的凋亡，并通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate Oxidase 4, NOX4)/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通过抑制氧化应激。表明在帕金森疾病状态下，整个纹状体脑区的细胞都处于炎症和应激状态，MSC-Exo通过整体调控这种失控状态而达到治疗作用，但是具体的作用分子有待进一步研究，后续研究中会用组学等方法确定MSC-Exo的具体作用物质，以及它的靶向分子，为MSC-Exo治疗帕金森提供更为具体的证据。

2 结果

2.3 免疫印迹结果 在第4天，PD组小鼠纹状体的TH蛋白表达相比于Sham组显著降低(

<0.05)，而与PD组相比，PD+MSC-Exo组的TH表达量上升(

<0.05)，见表2，图2。PD组小鼠在第4天时，脑组织的炎症因子TNFα和IL-1β表达显著高于Sham组(

<0.01)，而PD+MSC-Exo组的这两种炎症因子的表达明显低于PD组(

<0.01)。同时发现，第4天时，氧化应激通路分子Nrf2和Keap1相较于Sham组在PD组高表达(

<0.01)，而与PD组相比在PD+MSC-Exo组显著下调(

<0.01)。见表3，图3。

由于阳极铜飞边毛刺多、几何尺寸误差偏大，蒸汽供应不稳定，阴极铜外观质量不佳，表面粒子较多，直到10月份，外观质量得到稳定。投产以来，阳极板平均铜含量达到99.6%，加之新液生产，电解液杂质含量低，阴极铜成分均达到高纯铜标准，连续5批阴极铜成分见表2。

2.1 小鼠行为学结果 实验发现，连续4次(间隔2h)给MPTP后，成功诱发小鼠急性帕金森模型，行为学症状明显，在第4、14、30天，给予阿扑吗啡后，PD+MSC-Exo组和PD组小鼠的转圈数显著高于Sham组(

<0.01)，PD+MSC-Exo组小鼠转圈数明显低于PD组(

<0.01)。见表1。

3 讨论

MSC因其具有自我复制、多向分化、免疫调控、神经营养等生物学特性，目前已成为基础研究和临床试验应用最为广泛的干细胞之一，其来源的外泌体能够穿透血脑屏障，在神经系统疾病治疗以及靶向载药中有巨大的潜在价值。MPTP具有多巴胺神经毒性，进入脑部后，能够进入多巴胺能神经末梢和胞体，破坏黑体多巴胺能神经元，导致纹状体神经末梢、多巴胺地址的大量减少，最后产生神经毒性，诱发帕金森疾病

。MSC衍生外泌体成分可对抗神经炎症，增强抗氧化能力和神经营养因子的表达

，因此MSC-Exo应该对帕金森也有良好的治疗效果。

2.2 尼氏染色结果 在第30天尼氏染色结果发现，与Sham组相比，PD组小鼠的阳性染色显著减少，神经元损失严重，而与PD组相比，PD+MSC-Exo组的神经元损失减少，数量增多，见图1。

1.4 评定指标 ①旋转实验：在第4、14和30天，进行阿朴吗啡诱导的旋转试验，每组10只，以评估受损纹状体的超敏反应。小鼠皮下注射阿扑吗啡(0.05 mg/kg)后，放到旋转仪中，观察旋转情况，同时使用视频跟踪系统测量30min内的旋转次数。②尼氏染色：在第30天用4%多聚甲醛全身灌注固定后，取大脑进行石蜡包埋，每组5只，切片到纹状体，依次过二甲苯、无水乙醇、95%酒精、80%酒精、70%酒精和蒸馏水，然后1%焦油紫染色30min，蒸馏水清洗，70%酒精分色数秒至数分钟，依次经70%酒精、80%酒精、95%酒精，各2min脱水，无水乙醇2次，每次5min，二甲苯2次，每次10min，DPX封片。显微镜下观察拍片分析。③免疫印迹：取第4天的纹状体，每组5只，RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液超声(50w，5min)提取蛋白，12000rpm，10min，4℃离心，取上清液，BCA法进行定量。进行SDS-PAGE，每孔蛋白30ug，80V 30min，120V 1h；然后进行转膜，300 mA恒定电流，120 min将蛋白转至聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride，PVDF)(Millipore,MA,USA)膜；室温下将膜在封闭液中封闭2 h，然后一抗孵育过夜核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2) (1∶1000)、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(kelch-likeECH-associated protein 1, Keap1) (1∶1000)、酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase , TH)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNFα)、白介素1β(interleukin-1β, IL-1β)、β-肌动蛋白(β-actin)，三羟甲基氨基甲烷缓冲液(tris buffered saline with tween, TBST)洗涤后，室温下孵育二抗2 h，TBST 洗涤3次。加上发光液后使用Bio-Rad成像系统(Bio-Rad, Hercules, California, USA)显示条带，Image Lab软件分析灰度值。

唐五代时期，“过”用于非位移动词后的情况开始出现，如：例(12)，且“过”在这些例子中不再表示动作行为的趋向，其语义已经虚化，在这些例子中“过”表示动作行为的完成和结束，即“过1”，至此动态助词“过1”产生，用例不是很多。但是唐五代“过”作趋向补语的用例特别的多，比魏晋时期增多，如：例(11)等。

类似地，MSC-Exo对癫痫小鼠也具有治疗作用，能够提高其认知和学习记忆能力，降低炎症

，能够改善阿尔茨海默病小鼠的认知损伤，减少海马神经元丢失，抑制海马神经元氧化应激

，减轻小鼠缺血后的神经功能缺损、梗死体积、脑水肿和神经元损伤，降低中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞的浸润，具有神经保护作用

。表明MSC-Exo确具有免疫调控和神经保护作用，在治疗帕金森疾病方面具有巨大的应用潜力。

许多研究者采用菜薹的带柄子叶、原生质体、游离小孢子等进行培养，均取得了一定的成果[2-4]。张鹏等[5]研究认为菜薹以子叶-子叶柄为外植体，不定芽诱导率最高。而何晓明等[6]则认为菜薹再生能力在不同品种间差异很大，Zhang等[7]指出大白菜的基因型对它的再生能力影响极大，虽然一些菜薹品种已经可以进行再生，但是由于材料的专一性强，许多未研究过的品种在基因工程技术方面的应用还是会受到限制。因此，笔者以未报道的红菜薹为研究对象，以带柄的子叶为外植体，探讨TDZ、NAA等不同激素浓度对再生体系的影响，旨在为其在生物技术育种层面上的研究奠定基础。

在MPTP诱发的急性帕金森小鼠模型中，给予MSC-Exo后，神经元的损失减少、TH表达上升，炎症因子和氧化因子分子的表达也趋于正常，显示MSC-Exo在治疗帕金森以及其他神经疾病方面具有广泛的潜力。

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