不同氮源供体对湛江等鞭金藻生长和生理特性的影响

吕 布，梁 晶，廖晓言，臧 战，VASQUEZ Hebert Ely，王爱民，郑 兴，顾志峰

（海南大学海洋学院/南海海洋资源利用国家重点实验室，海南 海口 570228）

湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)是一种海洋金黄色鞭毛微藻，被应用于不同的饲料工业和海水养殖系统，在室内和室外均被广泛养殖，具有大规模培养和应用潜力[1-3]。

营养盐是湛江等鞭金藻生长中不可或缺的要素之一。目前，湛江等鞭金藻大规模培养时，常用氮源为硝酸钠，在微藻培养中起到重要作用[4]，然而硝酸钠作为一种强氧化剂、危险品，不易购买且成本较高，因此需要考虑采用一种低成本、易获得的营养盐进行生产[5]。海水中痕量金属元素、有机碳化合物对湛江等鞭金藻的影响早在21 世纪初就有报道[1]，但过量的Cu 离子容易对湛江等鞭金藻产生致毒效应[6]，同时生产中湛江等鞭金藻利用葡萄糖和乙酸钠进行兼养生长的能力也是有限的。总体上看，很多研究关注氮源、培养条件以及培养条件优化对湛江等鞭金藻的影响，但是大多研究NaNO3作为氮源供体对湛江等鞭金藻的影响[3,7-8]，而其它适宜氮源作为氮源供体培养湛江等鞭金藻的研究相对较少，尤其鲜见利用低成本氮源培养湛江等鞭金藻的研究报道。

减轻营养成本的一种替代方法是使用基于工业级的非常规培养基，在培养基中掺入工业级化肥或工业级化学品[9-11]，本研究以湛江等鞭金藻为研究对象，在纯营养液中使用这种类似方法，用廉价的商业肥料代替纯营养液和昂贵的营养液，通过对比多种商业氮肥对湛江等鞭金藻生长及生理特性的影响，探索一种相对低成本、高效的氮源，为实现湛江等鞭金藻低成本、高效、规模化培养提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

所用湛江等鞭金藻来源海南大学海洋学院微藻保种室。实验前将藻种进行纯化扩培，取快速生长期的藻液开展室内培养实验。湛江等鞭金藻采用的培养基配方如下：氮源供体为（NaNO3100 mg、NH2CONH235.33 mg、化肥尿素76.14 mg、NH4Cl 62.94 mg、CH3COONH490.95 mg、胰蛋白胨63.54 mg）、NaH2PO410 mg、FeSO42.5 mg、MnSO40.25 mg、EDTA-2Na 10 mg、VB16×10-3mg、VB120.5×10-6mg、过滤海水1 L。

上述配方所用培养液以“宁波3#微藻培养液”为基础，将100 mg NaNO3为氮源，作为NaNO3配方(实验A)。由于100 mg的NaNO3中含氮约16.47 mg，折算成NH2CONH2约为35.33 mg，折算成化肥尿素（复合肥，总氮质量分数≥46.4%）约为76.14 mg，折算成NH4Cl为62.94 mg，折算成CH3COONH4为90.95 mg，折算成胰蛋白胨为63.54 mg（用氮的相对原子质量与其分子的相对分子质量之比进行换算）。以35.33 mg 的NH2CONH2为氮源，作为NH2CONH2配方(实验B)；以76.14 mg 化肥尿素为氮源，作为化肥尿素配方(实验C)；以62.94 mg 的NH4Cl 为氮源，作为NH4Cl 配方(实验D)；以90.95 mg 的CH3COONH4为氮源，作为CH3COONH4配方(实验E)；以63.54 mg胰蛋白胨为氮源，作为胰蛋白胨配方(实验F)。

实验所用水体为经过沙井过滤、沉淀，漂白水消毒，高压灭菌锅灭菌后的自然海水（盐度32）。

1.2 实验设计

1.2.1 藻种的纯化培养 实验前将藻种进行纯化扩培，取快速生长期的藻液开展培养实验，将处于指数生长期的湛江等鞭金藻用培养基调整到相同数量级(104mL-1)，经离心(3 500 r/min，10 min)后接种。

1.2.2 不同低成本氮源培养基对藻的生产效果影响

研究NaNO3(100 mg·L-1)、CH3COONH4(90.95 mg·L-1)、胰蛋白胨(63.54 mg·L-1)、NH4Cl(62.94 mg·L-1)、尿素(35.33 mg·L-1)和化肥尿素(76.14 mg·L-1)这6 种氮源组成的培养基对藻类生长和水体中养分吸收的影响。在“宁波3#微藻培养液”的基础上，采用不同含氮化学物质替代昂贵的实验室分析纯化学物质，以补充湛江等鞭金藻生长所需主要营养物质。包括对照组在内的所有处理共设3 个平行，研究周期持续21 d。

湛江等鞭金藻在经过高压灭菌锅灭菌后的自然海水中光自养培养，在LED照明的5 000 mL锥形瓶中进行，用LED 灯从培养液的一侧照射，平均温度为（25±1）℃，照度为5 500 lx，光暗周期为12 h/12 h，用空气过滤头过滤空气，连续充气通入培养液。

实验组别接入藻种混匀后，每24 h，于上午进行取样，进行藻类细胞数目、干质量、色素含量、总蛋白含量及可溶性糖含量指标的检测。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 藻细胞数目测定 采用血细胞计数板法进行测定[12]。

1.3.2 藻细胞干质量的测定 预先称质量，烘干Whatman GF/C 过滤膜，将一定体积的藻液在该膜上过滤，经过冲洗除营养盐后，放到105 ℃烘箱中烘干72 h 以上后称质量，直至前后两次质量差不超过2 mg，然后计算两者的差值代表干质量[13-14]。

1.3.3 胞内生物质测定 1)叶绿素质量浓度：利用丙酮萃取法提取微藻体内叶绿素，取待测藻液样品20 mL，通过抽滤于Whatman GF/C 膜上，随后用镊子将Whatman GF/C 膜取下置于50 mL 离心管底部，加入10 mL 体积分数90%丙酮溶液，立即放入4 ℃冰箱中避光保存24 h 以上（1～3 d 均可），黑暗低温条件下进行萃取。萃取后在4 ℃、4 000 r/min 条件下离心10 min，将离心后的提取液上清液小心注入1 cm 比色皿，以体积分数90%丙酮溶液作参比，分光光度计（岛津UV-1700）分别测定在波长630、647、664 nm处溶液的光密度值（D630、D647、D664）并记录,减去波长750 nm 下测得的光密度值，得到校正后的D664、D647、D630值。按照以下方程式计算叶绿素a（ρchla）、叶绿素b（ρchlb）和总叶绿素（ρtchl）的质量浓度[15-16]。

式中，ρchla、ρchlb、ρtchl表示叶绿素a、b 和总叶绿素的质量浓度，mg·L-1；V表示实验用藻液体积，mL。

2)总蛋白质含量：称质量0.1～0.3 g待测样品放到锡纸中，将样品依次放入对应位置中。开始测定，设定燃烧反应炉(960 ℃)、通氧量为170 mL/min，充分燃烧300 s，当氧剩余量为12%时停止燃烧。燃烧反应炉中的试剂依次为280 g氧化铜，13 g银丝，15 g铂。燃烧炉中的产物进入TC检测器检测[17]，以上各项参数检测参考《食品安全国家标准》（GB5009.5-2016）。

3)可溶性糖含量：称取0.1 g 被测样品，按m糖∶m水=1∶10 加入蒸馏水，沸水浴60 min 后，取出离心管，放入30 mg 活性炭，混匀，静置30 min，过滤，加3 mL 无水乙醇，用蒸馏水定容至15 mL。取提取液1 mL 于刻度离心管内，加5 mL 蒽酮试剂，拧好盖子，沸水浴10 min 之后将离心管用自来水冲洗至室温，20 min 后在630 nm 处测光密度值，根据标准曲线，得出可溶性糖含量[18]。

1.3.4 水质测量方法 测量的水质指标：总氮，检测方法是镉柱还原法；总磷，检测方法是正磷酸盐用抗坏血酸还原磷钼蓝法来测定（HJ 671-2013）。以上各项参数检测主要参照《海洋监测规范》（GB/T 12763-2007）和《海洋监测标准》（GB17378-2007）中水样保存方法，根据实验目标间隔一定时间取样[19]。

1.4 数据处理与统计

（1）数据换算处理：生产力PI和比生长速率(µ)通过下述公式进行计算[5]：

式中：PI，生产力，g·(L·t)-1；ρi，初始生物量质量浓度，g·L-1；ρm，最大生物量质量浓度，g·L-1；Tc，与最大生物量质量浓度有关的培养时间(d)。

（2）统计分析：实验所得数据均以平均值±标准差进行表示。采用GraphPad Prism 9 和DPS 14.5软件进行数据处理和统计分析。采用单因素方差分析法进行差异性显著分析，当P ＜0.05 时差异显著。

2 结果

2.1 不同氮源对湛江等鞭金藻生产力和比生长速率的影响

氮源为化肥尿素培养下的湛江等鞭金藻生产力和比生长速率显著优于硝酸钠（P ＜0.05，表1）。化肥尿素的生产力和比生长速率最高，分别为（0.160 7±0.003 7）g·(L·d)-1、（0.439 8±0.002 3）d-1，硝酸钠分别为（0.102 1±0.000 2）g·(L·d)-1、（0.367 8±0.000 1）d-1。而氯化铵相对最低，分别为(0.048 0±0.002 7)g·(L·d)-1、(0.282 8±0.004 7)d-1。综合以上，从生产力上看，湛江等鞭金藻不同氮源对生产力的影响从大到小依次是化肥尿素＞硝酸钠＞乙酸铵＞尿素＞胰蛋白胨＞氯化铵；从比生长速率上看，湛江等鞭金藻不同氮源对比生长速率影响从大到小依次是化肥尿素＞乙酸铵＞硝酸钠＞胰蛋白胨＞尿素＞氯化铵。

表1 不同氮源培养下湛江等鞭金藻生产力和比生长速率的差异Table 1 Difference of productivity and specific growth rate of I.zhanjiangensis under different nitrogen sources

2.2 不同氮源对湛江等鞭金藻生长的影响

湛江等鞭金藻不同氮源培养对生长整体呈先缓慢增长后快速增长，随后呈稳定状态，最后开始降低的趋势，且氮源为化肥尿素培养下趋势变化最为明显（图1）。氮源为化肥尿素培养的湛江等鞭金藻在7 d时开始进入快速生长期（4.90±1.15）×106mL-1，并在19 d 时细胞密度达峰值（2.02±0.10）×107mL-1且开始进入平稳期。氮源为硝酸钠培养的湛江等鞭金藻在7 d 时开始进入快速生长期（5.95±0.51）×106mL-1，并在13 d时细胞密度达峰值（1.42±0.07）×107mL-1且开始进入平稳期。氮源为胰蛋白胨培养下快速生长时间相对较短，在6 d 时达到峰值（6.29±1.07）×106mL-1，但显著低于氮源为化肥尿素培养下的峰值（P ＜0.05）。综合以上，从生长上看，湛江等鞭金藻不同氮源培养下的最高藻密度从大到小依次是化肥尿素＞硝酸钠＞乙酸铵＞尿素＞氯化铵＞胰蛋白胨。

图1 6种不同氮源对湛江等鞭金藻生长密度的影响Fig.1 Effects of six different nitrogen sources on the growth density of I.zhanjiangensis

2.3 不同氮源对湛江等鞭金藻色素含量的影响

湛江等鞭金藻不同氮源培养下的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素质量浓度整体都呈先缓慢增长后快速增长，随后呈稳定状态，最后开始降低的趋势，且氮源为化肥尿素培养的趋势变化最为明显（图2）。氮源为化肥尿素培养下叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素质量浓度分别在11、11、13 d时开始进入快速增长期（0.53、0.19、0.82 mg·L-1），并在21 d 时叶绿素a、叶绿素b 和总叶绿素质量浓度分别达峰值（1.02、0.67、2.21 mg·L-1）且开始进入平稳期；氮源为硝酸钠培养的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素增长趋势相对平缓，且叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素质量浓度的峰值显著低于化肥尿素（P ＜0.05）。氮源为胰蛋白胨在培养5、4、5 d时叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素质量浓度分别达峰值0.36、0.24、0.81 mg·L-1。综合以上，从叶绿素质量浓度上看，湛江等鞭金藻不同氮源培养下的最高叶绿素a质量浓度从大到小依次是化肥尿素＞尿素＞乙酸铵＞硝酸钠＞氯化铵＞胰蛋白胨；湛江等鞭金藻不同氮源培养下的最高叶绿素b质量浓度从大到小依次是化肥尿素＞硝酸钠＞胰蛋白胨＞乙酸铵＞尿素＞氯化铵；湛江等鞭金藻不同氮源培养下的最高总叶绿素质量浓度从大到小依次是化肥尿素＞硝酸钠＞尿素＞乙酸铵＞胰蛋白胨＞氯化铵。

图2 6 种不同氮源对湛江等鞭金藻叶绿素a、叶绿素b 和总叶绿素质量浓度的影响Fig.2 Effects of six different nitrogen sources on chlorophyll a,chlorophyll b and total chlorophyll concentration of I.zhanjiangensis

2.4 不同氮源培养水体中湛江等鞭金藻对水质中氮磷的吸收差异

湛江等鞭金藻不同氮源培养水体中对水质中的TN 和TP 整体吸收都呈先快速上升后缓慢上升，随后呈稳定状态的趋势，且氮源为胰蛋白胨培养的TN和氮源为化肥尿素培养的TP趋势变化最为明显（图3）。以硝酸钠、尿素、化肥尿素、氯化铵、乙酸铵和胰蛋白胨为氮源培养8 d 时，TN 吸收率分别为97.1%、48.5%、69.6%、53.2、76.6%和98.2%；TP 吸收率分别为72.6%、97.9%、95.8%、68.4%、68.8% 和91.7%，培养21 d 时，TN 吸收率分别 为99.4%、99.4%、94.2%、88.3%、98.2%和99.9%；TP 吸收率分别为91.6%、99.9%、99.0%、98.9%、95.8%和96.9%。综合以上，从TN 吸收率上看，湛江等鞭金藻不同氮源培养水体中对水质中TN 的最大吸收率从大到小依次是胰蛋白胨＞硝酸钠=尿素＞乙酸铵＞化肥尿素＞氯化铵；湛江等鞭金藻不同氮源培养水体中对水质中TP 最大吸收率从大到小依次是尿素＞化肥尿素＞氯化铵＞胰蛋白胨＞乙酸铵＞硝酸钠。

图3 6种不同氮源对湛江等鞭金藻总氮、总磷的影响Fig.3 Effects of six different nitrogen sources on TN、TP of I.zhanjiangensis

2.5 不同氮源对湛江等鞭金藻有机物含量影响

氮源为化肥尿素培养下的湛江等鞭金藻有机物质量浓度最佳，其次为氮源为硝酸钠的培养基，氮源为胰蛋白胨的培养基的有机物含量最低，且有机物含量之间存在显著性差异（表2，P ＜0.05）。氮源为化肥尿素的有机物质量浓度最高，最大生物量干质量、最高总蛋白质质量浓度和最大可溶性糖质量浓度分别可达（1.626 9±0.036 8）g·L-1、（1 037.752 7±14.030 9）mg·L-1、（39.559 9±0.323 5）mg·L-1，显著高于氮源为硝酸钠的培养基[（1.143 5±0.001 7）g·L-1、（733.118 3±6.284 6）mg·L-1、（28.010 1±0.222 3）mg·L-1]，和氮源为胰蛋白胨的培养基[（0.507 5±0.057 1）g·L-1、（326.366 2±7.112 1）mg·L-1、（12.478 9±0.273 4）mg·L-1）]（P ＜0.05）。综合以上，从不同氮源生物量干质量上看，湛江等鞭金藻不同氮源培养下的最大生物量干质量从大到小依次是化肥尿素＞硝酸钠＞乙酸铵＞尿素＞氯化铵＞胰蛋白胨；湛江等鞭金藻不同氮源培养下的最高总蛋白质质量浓度从大到小依次是化肥尿素＞硝酸钠＞乙酸铵＞尿素＞氯化铵＞胰蛋白胨；湛江等鞭金藻不同氮源培养下的最大可溶性糖质量浓度从大到小依次是化肥尿素＞硝酸钠＞乙酸铵＞尿素＞氯化铵＞胰蛋白胨。

表2 不同氮源培养下湛江等鞭金藻有机物含量之间的差异Table 2 Differences of organic matter contents of I.zhanjiangensis under different nitrogen sources

3 讨论

3.1 湛江等鞭金藻6种不同氮源培养基的比较

氮是微藻生长的基本元素之一，在蛋白质、嘧啶、叶绿素的合成以及脂类化合物的储存中起关键作用，微藻生长、发育、繁殖过程中可以利用的氮源包括氨氮、硝态氮和尿素等，每一种微藻对不同氮源的利用效率也有差异[20]。本实验中，湛江等鞭金藻利用化肥尿素作为氮源时表现出最高的生产力和比生长速率，这与詹静婷等[21]使用的NH2CONH2相比，要高于其比生长速率（0.222 d-1），而与该实验中使用NH2CONH2的比生长速率相比，二者较为接近，但因为二者使用的NH2CONH2浓度不同，因此结果会有所不同。NH2CONH2在相应的酶的作用下，会水解生成氨和二氧化碳，为湛江等鞭金藻提供氮源和光合作用所必需的二氧化碳，且其所溶解的水溶液呈中性反应，故不会改变溶液的pH 值。湛江等鞭金藻能够很好利用尿素作为氮源，推测该藻细胞中可能含有相应的尿素酶，使得藻细胞在此条件下可以获得较大生长速率和生物量[22]，李朝霞等[23]采用NH2CONH2作为氮源对等鞭金藻的培养结果表明，球等鞭金藻3011 可以很好利用NH2CONH2作为氮源，丁彦聪等[24]研究也证明，微藻能利用多种氮源，以NH2CONH2作为氮源，小球藻生长速度快，脂肪酸和总脂的含量也明显增加，本研究与他们的研究结果一致，这也说明湛江等鞭金藻具有利用尿素的潜力。且化肥尿素作为氮源，湛江等鞭金藻的生产力也显著高于其它培养基，我们认为可能是对于NH2CONH2，其成分单一，也就是说能够为微藻所提供的也只是氮元素，而复合肥可以提供两种或两种以上的营养元素，里面包含更多的藻类生长因子，可以补充微藻所需的多种营养元素，均衡微藻生长所需的营养，非常适合藻类生长，因此，藻密度可达最高，但其分解需要更多时间。本研究发现，在8 d 时，对化肥尿素中TN 的吸收率要显著低于硝酸钠、乙酸铵和胰蛋白胨，但相对于NH2CONH2是有所提高的（图3，P ＜0.05），在碱性环境中，可以方便NH2CONH2分解，它可能会比其他不同的氮源获得更高的比生长速率[25]。而氮源为胰蛋白胨时，湛江等鞭金藻的比生长率为0.36 d-1，略高于刘东超等[26]实验中最佳NaNO3浓度的生长率（0.34 d-1）。本研究也发现，使用胰蛋白胨作为氮源，可以在短时间内迅速达到最高藻密度，其TN 吸收率在8 d 时可以达到最高（图3），本研究认为由于胰蛋白胨属于蛋白质氮源，微生物在有机氮源培养基中，可以直接利用游离氨基酸，合成用于构成细胞的蛋白质和其它细胞物质，微生物对氨基酸的利用是有选择性的，它可能更符合藻类细胞的吸收转换、藻细胞生长更快，可以大大缩短生长周期[24]，但使用胰蛋白胨，氮源成本增加36.07 %，短期需要可以使用，但不适合长期使用，也可以与其他氮源混合，可能会达到更好效果。该研究表明，优化的化肥尿素培养基配方是培养湛江等鞭金藻最优质的培养基，显著优于硝酸钠、NH2CONH2以及其他氮源培养基。

3.2 湛江等鞭金藻对色素含量及有机物含量的影响分析

微藻种类不同，对营养要求也是有差别的，每一种藻类都有适合各自生长繁殖的培养基。培养基中营养盐的种类影响着微藻的生长率、细胞的成分、叶绿素以及最后产量[26-27]。因此，选择培养基时，满足微藻生长所需的适宜营养成分和数量比例，是获得最佳培养效果的前提条件。本研究发现，使用化肥尿素为氮源培养基培养金藻时更利于其叶绿素及胞内有机物的积累。且在相似盐度下，本研究中使用化肥尿素为氮源的培养基培养的叶绿素质量浓度和蔺红苹等[3]研究中的叶绿素质量浓度相差不大。此外，本研究发现实验周期内不同氮源培养基配方培养的湛江等鞭金藻有机物的质量浓度并不一致，化肥尿素氮源培养基中湛江等鞭金藻总蛋白质质量浓度和可溶性糖质量浓度显著高于其他5 种氮源培养基配方，与黄振华等[1]使用的250 mL 锥形瓶培养的湛江等鞭金藻的蛋白质质量浓度相比，该研究使用的化肥尿素培养基配方要高于其研究中的蛋白质质量浓度，是具有优势的。

3.3 湛江等鞭金藻低成本氮源培养基配方的开发与利用

有研究表明，在培养基中用适当的农业肥料代替无机盐对某些藻类进行培养，不仅其效果与无机盐作用相似，而且大大节约了生产成本[28]。本研究结果发现，在不影响藻类生长和产量的前提下，以廉价、易得的工业级化学品替代分析纯化学品的主要化学成分，成功配制出一种可替代的低成本养殖培养基。在实验C中采用工业级化肥尿素替代商业化分析纯氮源，其理化性质和养分含量与标准培养基中没有太大差异。此外，与标准培养基相比，改良的氮培养基在光密度、生物量干质量、叶绿素a质量浓度、叶绿素b 质量浓度、总叶绿素质量浓度、总蛋白质质量浓度等方面均有显著提高(P ＜0.05)。根据成本计算，可以发现，相对于硝酸钠，利用在当地容易获得的廉价的氮源生长介质进行培养，可显著降低生产成本，这可能是因为绝大多数藻利用硝酸盐，其藻细胞蛋白质中的氮呈还原态，必须通过异养菌将硝酸盐中氮的高氧化态还原成亚硝酸盐，再还原成氨才能被单胞藻所利用，因此在藻类代谢硝酸盐中，必须经历一个还原过程，这要消耗呼吸作用分解有机物产生的能量，因而藻类在利用硝酸盐时，相对来说是不经济的[23]。本研究突出了新型改良培养基的优势，它不仅是一种高产投入物，而且也是一种低成本替代物，可在实际环境下用于湛江等鞭金藻的大规模物质生产。为扩大该配方应用范围，在本研究基础上，未来将进一步探讨化肥尿素、胰蛋白胨、浓度与湛江等鞭金藻的细胞化学组成的关系及其影响机制等。

4 结论

氮源为化肥尿素的培养基培养下的湛江等鞭金藻藻细胞生长、繁殖速度快，可快速进入指数生长期，具有藻液细胞浓度大，富含优质生物质的优点，饵料质量可得到强化。本研究结果为低成本、高效、规模化培养湛江等鞭金藻提供了依据，对促进湛江等鞭金藻养殖和饲料配方的发展具有现实意义。