BAT2基因缺失葡萄酒酵母的构建及其对葡萄酒高级醇的影响

闫统帅，周世水*，秦泽鑫，朱泳冲，郭 波

（1.华南理工大学 生物科学与工程学院，广东 广州 510006；2.广东石湾酒厂集团股份有限公司，广东 佛山 528031）

葡萄酒是历史悠久、种类繁多且酒文化丰厚的高档餐饮酒之一，富含氨基酸、维生素、有机酸、酚类和矿物质等营养元素[1]，具有延缓衰老、预防动脉硬化和心脑血管疾病等功能[2]。高级醇是形成葡萄酒醇厚度的重要因素，但也是形成异杂味并导致“上头”的主要原因[3]，正丙醇、异丁醇和异戊醇是其中主要关注的杂醇[4]。有研究表明，异丁醇和异戊醇含量过高会显著增加酒的苦味和醉度，而正丙醇的苦味阈值较高且醉度不显著[5-6]，葡萄酒中适度增加正丙醇还会使酒体醇厚感明显增强[7]。可见，大幅降低异丁醇、异戊醇含量，提高正丙醇含量，是酿造低苦味、低醉度葡萄酒的可行技术路线。

发酵酒中的高级醇主要来自主发酵前期酵母的生长代谢，主要由氨基酸分解[8]和丙酮酸合成[9]两条代谢途径生成，BAT2基因编码的支链氨基酸转移酶控制着氨基酸到高级醇的转化[10]，多数研究表明，敲除酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BAT2基因可以有效降低发酵酒中的异丁醇和异戊醇含量[11-13]。葡萄酒酵母比普通酿酒酵母更适合葡萄酒酿造，而敲掉葡萄酒酵母两个BAT2等位基因后，葡萄酒中含量最高的异戊醇并未下降[14]。双倍体酵母进行连续敲除涉及多次转化比较繁琐[15]，特别是针对转化率较低的遗传操作更为困难，关于利用杂合单等位基因敲除菌进行产孢，分离出不同配型的单倍体敲除菌进行融合获取纯合双等位基因敲除菌的育种方法的研究鲜见报道。

本研究从一株高产正丙醇的工业葡萄酒酵母BV-0出发，通过同源重组并结合酵母有性生殖的方式构建BAT2单、双等位基因缺失的两株葡萄酒酵母，并将两株酵母应用于葡萄酒发酵，通过调控高级醇间的比例来降低葡萄酒的苦味和醉度，从菌种选育方面为酿造低醉度、低苦味葡萄酒提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株和质粒

本研究所用的菌株和质粒见表1。

表1 本研究所用菌株和质粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

ApexHF HS脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶预混液、DNA凝胶回收试剂盒、GL DNA Marker 5 000：湖南艾科瑞生物科技有限公司；遗传霉素（G418）、博来霉素、蜗牛酶：北京普博欣生物科技有限责任公司；酵母提取粉、蛋白胨、琼脂粉（均为生化试剂）：广东环凯微生物科技有限公司；葡萄糖、半乳糖、乙酸钾（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；乙酸丁酯、丙酮（均为色谱纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；22种白酒标准品（纯度均＞98%）：滕州中科普仪器有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 培养基[16]

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基：酵母提取粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%，固体培养基则需外加2%琼脂粉。115 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

产孢培养基：乙酸钾1%，琼脂粉2%。115 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

T100聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）基因扩增仪：大龙兴创实验仪器股份公司；Tanon EPS 300电泳仪：上海天能科技有限公司；Gel Doc2000凝胶成像分析系统、411BR电转化仪：美国Bio-Rad公司；5804R高速台式冷冻离心机：德国Eppendorf公司；GC8100气相色谱（gas chromatography，GC）仪：滕州中科普仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物的设计与合成

依据美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnologyinformation，NCBI）中酿酒酵母S288C（序列号：NC_001144.5）的BAT2基因序列设计引物对BAT2-F1/R1、BAT2-F2/R2扩增BAT2基因的上下游同源臂用于同源重组，根据pUG6质粒序列设计引物对loxP-F/R扩增KanMX基因作为筛选标记，其中loxP-F/R引物两端引入上下游同源臂部分重叠碱基用于融合PCR获取敲除组件，同时设计两端验证引物BAT2-A/D及上下游验证引物B-M和M-B用于转化子的筛选鉴定，引物序列见表2，交由上海生工有限公司进行引物合成。

表2 本研究所用引物序列Table 2 Primer sequences used in the study

1.3.2BAT2基因敲除组件的构建

以葡萄酒酵母BV-0基因组和pUG6质粒为模板，按表2所列引物分别扩增BAT2基因的左、右同源臂和KanMX筛选标记，PCR扩增体系：无菌水17 μL，模板4 μL，引物对各2 μL，DNA聚合酶预混液25 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸40 s，共30个循环；72 ℃再延伸3 min。根据扩增出的KanMX基因片段两端与两同源臂之间重叠的部分碱基，利用融合PCR[17]将三个片段进行连接，并稀释作为模板，大量扩增敲除组件。

1.3.3 电转化

采用电转化[18]将敲除组件导入葡萄酒酵母BV-0中，吸取转化后的菌液200 μL涂布于含有150 μg/mL G418抗生素的YPD平板中，30 ℃条件下倒置培养2 d。

1.3.4BAT2单等位基因敲除菌的验证

挑取长势良好的转化子于10 μL无菌水的离心管中混匀，95 ℃加热2 min，立即放入-20 ℃冰箱冷冻10 min，吸取解冻后的菌液1 μL作为模板，采用两端验证引物和上下游验证引物进行PCR（PCR扩增体系：无菌水3 μL，模板1 μL，引物对各0.5 μL，DNA聚合酶预混液5 μL；PCR扩增条件：94 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃再延伸3 min。下同），筛选阳性克隆，将敲掉一个BAT2等位基因的葡萄酒酵母命名为BV-bk。

1.3.5 不同配型BAT2单等位基因敲除菌的构建

将菌株BV-bk点涂于产孢培养基，28 ℃培养1～3 d，刮取少量产孢的菌体用2%蜗牛酶进行破壁，重悬孢子[16]，并涂布于含有150 μg/mL G418抗生素的YPD平板上，30 ℃条件下倒置培养2 d。按照1.3.4的方法制备PCR的模板，利用配型验证引物确定长出酵母的配型[19]，并用两端验证引物进一步验证BAT2基因的缺失，获得BAT2基因缺失的单倍体酵母菌BVa1-bk和BVα2-bk。

1.3.6BAT2双等位基因敲除菌的融合获得

取两种不同配型的BAT2单等位基因敲除菌液各1 mL混合于灭菌的试管中，30 ℃、100 r/min条件下振荡培养8 h，取10 μL菌液在显微镜下观察细胞融合形态，将观察到有哑铃型的酵母融合菌液稀释10 000倍涂布于YPD平板，30 ℃条件下倒置培养2 d，挑取稍大的单菌落在显微镜下观察，将具有双倍体形态的酵母菌落点涂于产孢培养基，28 ℃培养1～3 d，若能产生孢子则为融合成功的双倍体酵母，将其命名为BV-BK[20]。

1.3.7KanMX抗性基因的去除

同样利用电转化将带有Cre重组酶基因的pSH65质粒导入含有抗性标记的双倍体葡萄酒酵母BV-bk和BV-BK中，利用半乳糖诱导产生Cre重组酶以切除掉两个loxP位点间的KanMX抗性基因，再通过影印平板和传代培养获得去除抗性标记的酵母菌株BV-b和BV-B[21]。

1.3.8 生长曲线的绘制

取一环斜面菌种于10 mL YPD液体培养基，30 ℃、220 r/min条件下活化培养24 h，再将菌液按3%（V/V）的接种量接种到100 mL YPD液体培养基中继续培养，每隔1 h取样2 mL测定菌体密度（OD600nm值），以OD600nm值为纵坐标，培养时间为横坐标绘制生长曲线。

1.3.9 敲除菌在葡萄酒发酵中的应用

将市售玫瑰葡萄用榨汁机打碎成浆液，取一环斜面菌种于10 mL YPD液体培养基中，30 ℃、220 r/min条件下振荡培养16 h，再将菌液按1%（V/V）的接种量转接到50 mL YPD液体培养基中继续培养12 h，最后按3%（V/V）的接种量接种于100 mL葡萄浆液中，18 ℃低温发酵7 d，发酵结束后用灭菌纱布过滤除去皮渣，将酒液静置澄清24 h，取上清测定其理化指标和高级醇含量。

1.3.10 测定方法

pH值：使用pH计测定；残糖含量：采用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法测定[22]；酸度：采用电位滴定法测定[23]；酒精度和高级醇[24-25]：采用气相色谱法测定。

1.3.11 数据处理

采用Graphpad8.02对数据进行整理绘图、SPSS28.0进行数据统计分析，结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 BAT2基因敲除组件的构建

BAT2基因的左、右同源臂、KanMX抗性基因的PCR扩增及敲除组件的构建结果见图1。由图1可知，从葡萄酒酵母BV-0基因组中成功扩增得到BAT2基因的左同源臂（320 bp）和右同源臂（415 bp），从pUG6质粒上成功扩增得到KanMX抗性基因（1 736 bp），通过融合PCR的方式将三个片段连接，成功获得BAT2基因的敲除组件（2 471 bp）。

图1 BAT2基因的左、右同源臂、KanMX抗性基因的PCR扩增及敲除组件的构建结果Fig.1 Results of PCR amplification of left and right homologous arms of BAT2 gene and KanMX resistance gene and construction of knockout components

2.2 BAT2单等位基因敲除菌的验证

两端验证及上下游验证结果见图2。由图2a可知，所挑选的转化子均只扩增出未重组染色体上的BAT2基因（1 870 bp），而经过同源重组被敲除组件替换的基因2 600 bp并未被扩增，推测可能是因为当两条基因都能PCR扩增且长度差异较大时，PCR扩增产物仅有短的基因，故必须对转化子进行上下游验证。由图2b可知，经过同源重组被敲除组件替换的基因的上游（1 082 bp）和下游（1 551 bp）的分子片段都能被扩增，说明葡萄酒酵母BV-0基因组内一条染色体的BAT2基因被敲除替换。

图2 BAT2单等位基因敲除菌BV-bk的两端验证（a）及上、下游验证（b）结果Fig.2 Results of two-end verification (a) and upstream and downstream verification (b) of BAT2 monoallelic knockout strain BV-bk

2.3 不同配型BAT2单等位基因敲除菌的分离鉴定

挑取能在G418平板上生长的BAT2单等位基因敲除菌进行PCR验证，结果见图3a。由图3a可知，成功分离出了两种配型的BAT2单等位基因敲除菌，即a型酵母BVa1-bk（544 bp）和α型酵母BVα2-bk（404 bp）。对分离出的BAT2单等位基因敲除菌进行两端验证，结果见图3b。由图3b可知，成功验证出重组后的基因片段，碱基长度为2 600 bp，表明两种不同配型的BAT2单等位基因敲除菌构建成功。

图3 单倍体BAT2基因敲除菌的配型验证（a）及敲除验证（b）结果Fig.3 Results of match verification (a) and knockout verification (b)of haploid BAT2 gene knockout strain

2.4 BAT2双等位基因敲除菌的融合获得

将两种配型的BAT2单等位基因敲除菌进行融合，观察BAT2单等位基因敲除菌的融合形态，结果见图4a。由图4a可知，有许多哑铃型细胞，表明BAT2单等位基因敲除菌正在融合。挑取融合后重新涂布平板的单菌落，观察细胞形态，结果见图4b。由图4b可知，酵母细胞呈圆形或椭圆形、细胞大而不发生集聚，具有明显的双倍体酵母特征。将具有双倍体形态的酵母菌落点涂于产孢培养基，观察产孢子情况，结果见图4c。由图4c可知，明显观察到有孢子产生，证实等位基因同时缺失的双倍体酵母菌株构建成功。

图4 BAT2双等位基因敲除菌株的融合及验证Fig.4 Fusion and validation of BAT2 biallelic knockout strains

2.5 KanMX抗性基因的去除

采用引物对BAT2-A/BAT2-D对影印平板法筛选得到的酵母菌株进行PCR验证，结果见图5。由图5可知，PCR扩增产物的碱基长度为1 093 bp，证实了KanMX抗性基因已成功被诱导表达出的Cre酶切除。

图5 KanMX抗性基因去除PCR验证结果Fig.5 PCR verification results of KanMX resistance gene removing

2.6 菌株的生长曲线

出发菌株BV-0、BAT2单等位基因敲除菌株BV-b和BAT2双等位基因敲除菌株BV-B的生长曲线见图6。由图6可知，菌株BV-b的生长速度略微低于出发菌BV-0，尤其是在对数生长期较为明显，但最终都能达到相同的菌体密度，这可能是BAT2基因的缺失影响了菌株对支链氨基酸的吸收能力[26]，延迟了酵母达到最大菌密度的时间。

图6 出发菌BV-0和BAT2基因敲除菌株BV-b和BV-B的生长曲线Fig.6 Growth curves of starting strain BV-0 and BAT2 gene knockout strain BV-b and BV-B

2.7 BAT2基因敲除葡萄酒酵母对葡萄酒的影响

2.7.1BAT2基因敲除葡萄酒酵母对葡萄酒基本理化指标的影响

葡萄酒的基本理化指标见表3。由表3可知，除BAT2双等位基因敲除葡萄酒酵母BV-B发酵的葡萄酒酒精度略微下降外（P＜0.05），菌种改造并不会显著影响葡萄酒的其他各项指标（P＞0.05），表明BAT2基因敲除的葡萄酒酵母可以在葡萄酒发酵中得到应用。

表3 葡萄酒基本理化指标的测定结果Table 3 Determination results of basic physicochemical indexes of wines

2.7.2BAT2基因敲除葡萄酒酵母对葡萄酒中高级醇含量的影响

利用气相色谱法测定葡萄酒中的高级醇，结果见图7。

图7 不同菌种发酵葡萄酒中高级醇含量的测定结果Fig.7 Determination results of higher alcohols contents in wines fermented by different strains

由图7可知，与出发菌株BV-0发酵的葡萄酒相比，2株BAT2基因敲除菌发酵的葡萄酒中异丁醇和异戊醇含量都有所下降（P＜0.05），其中菌株BV-b发酵的葡萄酒中异丁醇含量下降14.9%，异戊醇含量下降17.87%，分别为17.65 mg/L和83.20 mg/L；菌株BV-B发酵的葡萄酒中异丁醇含量下降67.0%，异戊醇含量下降31.1%，分别为6.85 mg/L和77.80 mg/L。菌株BV-b发酵的葡萄酒中正丙醇含量变化不显著（P＞0.05），而菌株BV-B发酵的葡萄酒中正丙醇含量上升36.55%，为203.15 mg/L（P＜0.05）。此外，两株BAT2基因敲除菌的总高级醇含量波动幅度较小，均接近适宜的范围（300 mg/L左右）[4]。

结果表明，BAT2单等位基因敲除菌株可以小幅度降低葡萄酒中异丁醇和异戊醇的含量（P＜0.05），而正丙醇含量变化不显著（P＞0.05），这与徐佳等[15]的研究结果相似，分析原因可能是BAT2基因缺失影响细胞质中支链氨基酸转移酶的表达，从而阻断缬氨酸和亮氨酸到异丁醇和异戊醇的转化，但由于等位基因的存在导致降低幅度较小。BAT2双等位基因敲除菌株发酵使葡萄酒中的异丁醇和异戊醇含量降低幅度较大（P＜0.05），且正丙醇也有大幅增加（P＜0.05），与张艳英等[21]的研究结果相似，这可能是因为氨基酸分解途径受阻后增强了丙酮酸合成途径对高级醇的贡献，但由于苏氨酸到正丙醇间的转氨酶不由BAT2基因控制，因此导致了代谢流到正丙醇的增加[4，27]。

本研究所用的葡萄酒酵母BV-0在发酵中会产生较高的正丙醇，这可能与酵母的特性有关，不同的葡萄酒酵母产生的高级醇有较大差异[28-29]，这种差异可能与转氨酶活性有关[30]。有研究表明，正丙醇的苦味和醉度远小于异丁醇和异戊醇[5-6]，但目前发酵的葡萄酒正丙醇含量普遍低，异丁醇和异戊醇含量高[31]，本研究构建的BAT2双等位基因敲除葡萄酒酵母可以有效调节高级醇间的比例，能在不影响葡萄酒醇厚度的同时降低其苦味和醉度。

3 结论

本研究通过融合PCR构建敲除组件，电转化到葡萄酒酵母BV-0中构建BAT2单等位基因敲除菌BV-b，然后利用双倍体酵母产孢到融合的有性生殖特性构建了BAT2双等位基因敲除菌BV-B。将两株敲除菌应用于葡萄酒发酵，结果发现，与出发菌株BV-0酿造的葡萄酒相比，菌株BV-b、BV-B所酿造葡萄酒的基本理化指标基本一致，而异丁醇含量分别下降14.9%、67.0%，异戊醇含量分别下降17.87%、31.1%。此外，菌株BV-B不仅对异丁醇和异戊醇的降低幅度较大，而且使正丙醇含量也提升了36.55%，从而在不影响葡萄酒醇厚度的同时降低其苦味和醉度，具有潜在的工业应用价值。