2,2-二溴-3-次氮基丙酰胺复合物杀菌效果的研究及中和剂选择
2022-09-27罗文姬许雅棋乐晓光张丽蓉邓金花宋金武
罗文姬 许雅棋 乐晓光 傅 鹏 张丽蓉 邓金花 宋金武
广东环凯生物技术有限公司，广东韶关，512029
膜污染是反渗透膜在水处理应用中的最大危害，不仅降低膜的运行效率，缩短其使用寿命，还使得产水量降低，产水水质不符合要求[1]。为此，膜系统运行一段时间后，一般会进行清洗消毒。目前常用的几种杀菌剂有甲基异噻唑啉酮（MIT）、甲基氯异噻唑啉酮（CMIT）、2,2-二溴-3-次氮基丙酰胺（DBNPA）、过氧化氢（H2O2）、过氧乙酸、含氯杀菌剂等。
DBNPA可有效杀灭引起植物枯萎的真菌[2]，是一种常见的广谱杀菌剂，用于工业的防霉杀菌。因为它的非氧化性质，杀菌时不容易损害膜元件，对精密度较高的膜元件非常友好[3]。DBNPA通常用来防止细菌和藻类在造纸、工业循环冷却水、金属加工用润滑油、纸浆、木材、涂料和胶合板中的生长繁殖，同时可做黏泥控制剂，广泛用于造纸厂纸浆和循环冷却水系统。作为广谱高效的杀菌剂，能迅速穿透微生物的细胞膜，并作用于一定的蛋白基团，使细胞的正常氧化还原中止，从而引起细胞死亡。同时，它的分支还可以选择性地溴化或氧化微生物的特殊酶代谢物，最终导致微生物死亡[4]。此外，DBNPA具有良好的剥离性能，使用时无泡沫，液体产品与水可任意比互溶，低毒[5-6]。
异噻唑啉酮类是一类广谱高效杀菌防腐剂，对微生物生长有很好抑制作用，可有效抑制细菌、霉菌及酵母菌的生长[7]。尤其在皮革行业，其防霉效果比甲醛[8]优。而甲基氯异噻唑啉酮（CMIT）和甲基异噻唑啉酮（MIT）以3∶1混合的凯松是常用的防腐杀菌剂[9]。但使用过多的CMIT、MIT会引起皮肤过敏，为此，可将其复配其他消毒剂，以降低使用浓度。
本研究以DBNPA为主要杀菌成分复合微量凯松作为复合杀菌剂，常规中和剂不能有效地中和该复合杀菌剂的作用，为此需要筛选出对本复合杀菌剂的有效中和剂，为杀菌效果评价提供有效的中和方法。实验探究根据主要杀菌成分结构选择不同中和剂组合，筛选有效的中和剂，探究不同作用时间和作用浓度的杀菌效果，并进行现场实验验证。
1 实验部分
1.1 实验准备
1.1.1 试剂材料
DBNPA（上海麦克林生化科技有限公司），CMIT/MIT（上海麦克林生化科技有限公司），D/E肉汤（广东环凯微生物科技有限公司），甘氨酸（国药集团有限公司），硫代硫酸钠（广州化学试剂厂），吐温-80（广州化学试剂厂），卵黄卵磷脂（广东环凯微生物科技有限公司），磷酸二氢钾（广州化学试剂厂），磷酸氢二钠（广州化学试剂厂），牛血清白蛋白（上海源叶生物科技有限公司），氯化钠（广州化学试剂厂），盐酸半胱氨酸盐酸盐（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），胰蛋白胨（广东环凯微生物科技有限公司），营养琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司），马铃薯葡萄糖琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司），纯水。
超净工作台DL-CJ-2N，恒温培养箱DNP-9277，分析天平AUT220，计时器。
1.1.2 中和剂的准备
因为复合膜杀菌剂主要消毒成分是DBNPA，其含有两个溴基团和一个次氮基作为端基，溴基团是卤素，参考二氧化氯、次氯酸钠、聚维酮碘等含卤素元素的消毒剂以及季铵盐类消毒剂的中和剂，得到下面几种中和剂组合。
（1）中和剂A：0.5%硫代硫酸钠+0.2%卵黄卵磷脂+1%吐温-80的PBS溶液。
（2）中和剂B：1%硫代硫酸钠+0.5%卵黄卵磷脂+1%甘氨酸+8%吐温-80的PBS溶液。
（3）中和剂C：0.3%卵黄卵磷脂+3%吐温-80+0.01%组氨酸+0.1%盐酸半胱氨酸盐酸盐+0.85%氯化钠的PBS溶液。
（4）中和剂D：1%硫代硫酸钠+0.5%卵黄卵磷脂+1%吐温-80的PBS溶液。
（5）中和剂E：0.5%硫代硫酸钠+0.5%卵黄卵磷脂+1%甘氨酸+8%吐温-80的PBS溶液。
（6）中和剂F：0.5%卵黄卵磷脂+3%吐温-80+0.05%组氨酸+0.3%盐酸半胱氨酸盐酸盐+0.85%氯化钠的PBS溶液。
1.1.3 中和产物配制
取消毒剂按1∶9分别与中和剂A-F混合，反应10 min，得到中和产物A-F待用。
1.1.4 实验指示菌
试验用金黄色葡萄球菌（ATCC 6538，广东环凯微生物科技有限公司）、大肠杆菌（ATCC 25922，广东环凯微生物科技有限公司）、铜绿假单胞菌（ATCC 15442，广东环凯微生物科技有限公司）、白色念珠菌（ATCC 10231，广东环凯微生物科技有限公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 菌悬液配制
根据《消毒技术规范》(2002版）2.1.1.2.3及2.1.1.9.3要求，取菌种第4～14代的营养琼脂培养基斜面新鲜菌落（18～24 h），配制菌悬液，使得最终细菌菌落数为1×108～5×108cfu/ml，真菌菌落数为1×107～5×107cfu/ml。
1.2.2 中和剂鉴定
1.2.2.1 实验步骤
按照实验分组，准备足量的试管和平皿并编号。配制125 mg/ml的DBNPA溶液。取2.0 ml菌悬液于试管中，加入2.0 ml有机干扰物质，得到含有机干扰物的菌悬液。其余步骤参照《消毒技术规范》(2002版）2.1.1.5.5进行。
1.2.2.2 评价规定
按《消毒技术规范》（2002版）2.1.1.5.7要求，中和剂合格需要满足：
（1）第1组无实验菌，或仅有极少数实验菌落生长。
（2）第2组有较第1组为多，但较第3、4、5（组）为少的实验菌菌落生长。
（3）第3、4、5组有相似量试验菌生长，悬液实验在1×107～5×107cfu/ml，其组间菌落数误差率应不超过15%。第3、4、5组间菌落数误差率计算见公式（1）。
（4）第6组无菌落生长。
（5）连续3次试验取得合格。
1.2.3 悬液定量杀菌实验
使用无菌硬水配制1.25倍评价浓度（0.03‰、0.05‰、0.1‰）的杀菌剂0.038‰、0.063‰、0.125‰的DBNPA溶液。
取0.5 ml步骤1.2.1配制好的菌悬液加入无菌大试管中，再加入0.5 ml有机干扰物质，震荡摇匀。用无菌吸管吸取上述浓度消毒剂4.0 ml，震荡均匀并立刻计时。作用时间分别为45 min、60 min、90 min、135 min。
待实验菌和消毒剂作用至规定时间后，分别吸取0.5 ml实验菌和消毒剂混合液，加入4.5 ml灭菌的中和剂中，混匀，作用10 min。
随后，根据菌落生长实际情况，进行系列10倍稀释后，分别吸取1.0 ml样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液接种2个平皿。
同时用稀释液代替消毒剂，进行平行实验，作为阳性对照组。
所有实验样本均在37 ℃恒温培养箱中培养48 h，观察最终结果。实验重复3次，计算各组活菌浓度（cfu/ml）,并换算为对数值（N），然后按公式（2）计算杀灭对数值，精确到小数点后两位。
1.2.4 现场实验
选择反渗透膜系统作为现场实验研究对象，根据反渗透膜清洗消毒步骤，对反渗透膜进行碱洗和酸洗后。往反渗透膜系统添加一定浓度DBNPA，循环30 min。停机浸泡60 min，随后排出消毒剂，用无菌水冲洗反渗透膜。取杀菌前后产水端水样500 ml，经过灭菌的滤膜过滤后，置于固体培养基平板上，进行37 ℃恒温培养。
2 结果与讨论
2.1 中和剂鉴定
实验结果表明（表1、表2），中和剂C、F的1、2、4组均不长铜绿假单胞菌，即中和剂C、F不能有效中和DBNPA的残留作用。而中和剂A、D、E的1、2组不长菌，3、4、5组铜绿假单胞菌、白色念珠菌的菌落误差均大于15%，即表明，中和剂A、D、E未能有效中和DBNPA的残留作用。使用中和剂B结果表明，第1、2组没有菌落生长，3、4、5组菌的含量相近，误差值满足＜15%的要求。
表1 六种中和剂中和复方膜杀菌剂对铜绿假单胞菌的残留作用
表2 六种中和剂中和复方膜杀菌剂对白色念珠菌的残留作用
综上所述，使用1%硫代硫酸钠+0.5%卵磷脂+1%甘氨酸+8%吐温-80的PBS溶液可有效中和DBNPA对实验菌的残留作用。同时，中和剂对实验菌和培养基没有不良影响，为此，本研究采用此中和剂。
2.2 悬液定量杀菌
从表3可知，作用时间为45 min时，0.03‰、0.05‰、0.1‰的复合膜杀菌剂对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的KL＜5.0，对白色念珠菌的KL＜4.0。当作用时间调整为60 min时（表4），浓度为0.05‰以上的复合膜杀菌剂对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌3种菌KL＞4.0，对白色念珠菌KL＞3.0。当作用时间增加至90 min时（表5），浓度为0.05‰以上的复合膜杀菌剂对3种细菌的KL＞5.0，对白色念珠菌KL＞4.0。当作用时间延长至135 min时（表6），3种浓度复合膜杀菌剂对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的KL＞5.0，对白色念珠菌的KL＞4.0。
表3 复合膜杀菌剂作用45 min杀菌效果
表4 复合膜杀菌剂作用60 min杀菌效果
表5 复合膜杀菌剂作用90 min杀菌效果
表6 复合膜杀菌剂作用135 min杀菌效果
2.3 现场实验
根据DBNPA的悬液定量杀菌实验，选择浓度为0.05‰的DBNPA对膜进行消毒，最终比较消毒前后产水的菌含量。结果显示，消毒前，系统菌落对数为4.13消毒后，膜系统菌含量为0，即DBNPA对该水处理系统的自然菌落有明显杀灭效果。
3 结论
通过作用基团入手筛选，最终得到了可以有效抵消复合膜杀菌剂消毒作用的中和剂，1%硫代硫酸钠+0.5%卵黄卵磷脂+1%甘氨酸+8%吐温-80的PBS溶液。通过不同作用时间的悬液定量杀菌试验，比较不同浓度下杀菌效果。实验结果表明，作用时间为90 min时，复合膜杀菌剂浓度0.05‰以上，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的KL＞5.0，对白色念珠菌KL＞4.0。结合工艺流程，现场实验结果显示，复合膜杀菌剂浓度0.05‰对水处理自然菌落有明显杀灭效果。
