淫羊藿苷减轻七氟醚诱导的小鼠认知功能障碍

雷 剑，张昌盛，吴 宝

(1.中国中医科学院广安门医院南区 麻醉科，北京 102618；2.中国人民解放军总医院 麻醉科，北京 100853)

术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction，POCD)为围手术期常见的并发症，表现为学习记忆能力下降、认知社交能力受损[1]。目前研究发现，临床上常用吸入性麻醉剂七氟醚(sevoflurane)是诱发老年POCD发生率升高的关键诱因之一[2]。已有研究证实，七氟醚会造成患者脑组织结构损伤及神经元炎性损伤及凋亡[3]。小胶质细胞是脑内的巨噬细胞，可由M1型促炎活性向M2型抗炎活性发展，并介导神经元免疫炎性反应[4]。近来研究发现，磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB，Akt)通路活化除介导细胞增殖、分化及凋亡作用外，还参与机体免疫应答和炎性因子释放过程[5]，预示PI3K/Akt通路可能是参与POCD患者海马神经元免疫炎性反应及凋亡的关键通路。淫羊藿苷(icariin)为淫羊藿中提取的黄酮类活性成分，具有免疫调节、抗感染、抗凋亡等多种药理作用，且具有较好的神经保护作用，并能够改善阿尔茨海默病动物的学习记忆能力[6]。但淫羊藿苷是否能减轻七氟醚诱导的小鼠认知障碍，还未见报道。本研究用七氟醚诱导建立POCD模型小鼠，并以PI3K/Akt通路为切入点进行探究验证，以期为淫羊藿苷的研究应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

C57BL/6小鼠，体质量20～22 g，清洁级，雄性[北京百奥赛图基因生物技术有限公司，SCXK(京)2020-0007]。试验符合3R(实验动物减少、优化和替代)原则，并经广安门医院伦理委员会批准IACUC-01(202001111)。

淫羊藿苷(滁州仕诺达生物科技有限公司)；PI3K抑制剂(LY294002)(上海一研生物科技有限公司，规格：10 mg)；PI3K激活剂(rh IGF-1)(北京百奥莱博科技有限公司)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒、白细胞介素-1β(IL-1β)ELISA试剂盒、神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)ELISA试剂盒(上海瓦兰生物科技有限公司)；尼氏及TUNEL染色液(北京伊塔生物科技有限公司及无锡菩禾生物医药技术有限公司)；M1型激活小胶质细胞标记抗体(CD11b)、M2型激活小胶质细胞标记抗体(CD206)、小胶质细胞标记抗体(ionized calcium bindingadaptor molecule-1，Iba-1)、TNF-α、IL-1β、IL-10、PI3K、磷酸化PI3K(p-PI3K)、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)、抗凋亡蛋白-Bcl-2等兔抗小鼠抗体(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分组及处理：将小鼠分为：对照组、模型组、淫羊藿苷组、PI3K抑制剂组、淫羊藿苷+抑制剂组、PI3K激活剂组，每组12只。除对照组外，其余各组小鼠参照文献[7]将小鼠放置于3%七氟醚+100%氧气预充透明半封闭麻醉箱中持续麻醉30 min后，取出经腹正中线约1.5 cm切口行腹腔探查术，手术约持续10 min后，用无菌丝线缝合肌肉筋膜及皮肤，建立POCD模型。对照组小鼠持续给予100%氧气30 min外，不进行任何处理，作为对照组。

各组均于术前3 d开始给药，淫羊藿苷组参照文献[8]设置剂量20 mg/kg，用0.9%氯化钠溶液溶解成浓度为2 mg/mL的混悬液，按10 mL/kg的剂量灌胃给药，1次/d；PI3K抑制剂组于麻醉前30 min参照文献[9]经腹腔注射PI3K/Akt抑制剂-LY294002(30 mg/kg)；PI3K激活剂组于麻醉前30 min参照文献[10]经腹腔注射PI3K激活剂-rh IGF-1，50 μg/kg；淫羊藿苷+抑制剂组腹腔注射PI3K/Akt抑制剂-LY294002的同时，灌胃给予淫羊藿苷进行干预处理。各组小鼠均于术后24 h进行后续实验。

1.2.2 小鼠认知功能障碍检测：条件恐惧实验：各组小鼠于造模后24 h，参照文献[11]将动物置于相同训练期的恐惧箱中进行训练，实验重复6次。以此评价其对恐惧事件认知能力。

Y迷宫空间探索实验：参照文献[11]设置Y迷宫空间探索实验，以此评价小鼠的空间识别记忆能力。

1.2.3 ELISA检测小鼠血清TNF-α、IL-1β及BDNF水平：各组小鼠测完认知功能后，取血约3 mL，ELISA检测血清TNF-α、IL-1β及BDNF水平。

1.2.4 尼氏及TUNEL染色观察海马神经元损伤及凋亡：解剖剥离，取完整海马组织，分成两部分，一部分置于-80 ℃冰箱保存备用；另一部分制备新鲜冰冻切片(20 μm)。取新鲜冰冻切片按尼氏及TUNEL染液说明书方法染色处理后，于光镜下观察拍照。TUNEL染色切片，随机取5个视野，用Image-Pro Plus 6.0软件记录分析每视野下凋亡细胞比例(%)=阳性染色为棕色细胞/每视野下总细胞×100%。

1.2.5 免疫荧光染色法检测小胶质细胞极化分型：CD11b标记M1型激活小胶质细胞，CD206标记M2型激活小胶质细胞，Iba-1标记小胶质细胞。取相同部位新鲜冰冻切片，晾干、0.3%曲拉通破膜、羊血清封闭处理后，加入1∶200的CD206、Iba-1一抗4 ℃孵育过夜，用1∶1 000的二抗(FITC，TRITC)室温避光孵育1 h，磷酸化缓冲液洗脱、DAPI核染及封片处理后，于荧光显微镜下观察。用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统计算每视野下CD11b、CD206、Iba-1阳性染色区域面积。以CD11b/Iba-1×100%及CD206/Iba-1×100%表示M1型与M2型极化分型。

1.2.6 Western blot检测海马组织蛋白表达：取冰冻海马组织，4℃解冻，粉碎及匀浆处理后，提取胞质蛋白，BCA法测蛋白浓度，取100 μg蛋白样品行电泳、转膜反应，4 ℃孵育盒中滴加1∶800的PI3K、p-PI3K、Akt、Akt、GSK-3β、p-GSK-3β、NF-κB、p-NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-10、S100A8、TLR4、Bcl-2一抗及1∶1 000的β-actin内参抗体孵育过夜，次日滴加HRP山羊抗兔二抗(1∶1 400)继续孵育30 min，增强化学发光法显影曝光后，用Image-J软件分析计算条带相对吸光度(A)值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 淫羊藿苷对小鼠认知功能的影响

与对照组相比，模型组小鼠5 min内的僵直时间、N臂停留时间缩短(P<0.05)。与模型组相比，淫羊藿苷组及PI3K激活剂组小鼠5 min内的僵直时间、N臂停留时间延长(P<0.05)；PI3K抑制剂组5 min内的僵直时间、N臂停留时间进一步缩短(P<0.05)。与淫羊藿苷组相比，淫羊藿苷+抑制剂组小鼠5 min内的僵直时间、N臂停留时间缩短(P<0.05)(表1)。

表1 小鼠5 min内的僵直时间、N臂停留时间比较

2.2 淫羊藿苷对小鼠血清TNF-α、IL-1β、BDNF水平的影响

与对照组相比，模型组小鼠血清TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05)，BDNF水平降低(P<0.05)。与与模型组相比，淫羊藿苷组及PI3K激活剂组小鼠血清TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05)，BDNF水平升高(P<0.05)；PI3K抑制剂组血清TNF-α、IL-1β水平进一步升高(P<0.05)，BDNF水平进一步降低(P<0.05)。与淫羊藿苷组相比，淫羊藿苷+抑制剂组小鼠血清TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05)，BDNF水平降低(P<0.05，P<0.05)(表2)。

表2 小鼠血清TNF-α、IL-1β、BDNF水平比较

2.3 淫羊藿苷对小鼠海马神经元损伤、凋亡的影响

对照组小鼠海马神经元形态正常、排列紧密、核仁清晰；模型组小鼠海马神经元体积变小、核固缩甚至消失、排列疏松、尼氏体模糊。TUNEL染色可见模型组凋亡细胞染色呈棕色。与对照组相比，模型组小鼠海马神经元核固缩、排列疏松等损伤严重，凋亡率升高(P<0.05)。与模型组相比，淫羊藿苷组及PI3K激活剂组小鼠神经元形态逐渐趋于正常，凋亡率降低(P<0.05)；PI3K抑制剂组小鼠神经元丢失及核固缩现象进一步加重， 凋亡率进一步升高(P<0.05)。与淫羊藿苷组比较，淫羊藿苷+抑制剂组小鼠神经元损伤严重，凋亡率升高(P<0.05)(图1，表3)。

表3 小鼠海马神经元凋亡率比较

2.4 淫羊藿苷对小鼠小胶质细胞分型的影响

CD11b、CD206标记的M1型及M2型激活小胶质细胞为红色荧光；Iba-1标记的小胶质细胞为绿色荧光。与对照组相比，模型组小鼠海马组织M1型(CD11b/Iba-1)、M2型(CD206/Iba-1)阳性表达面积升高(P<0.05)。与模型组相比，淫羊藿苷组及PI3K激活剂组小鼠M1型(CD11b/Iba-1)阳性表达面积降低(P<0.05)，M2型(CD206/Iba-1)阳性表达面积升高(P<0.05)；PI3K抑制剂组小鼠M1型(CD11b/Iba-1)阳性表达面积进一步升高(P<0.05)，M2型(CD206/Iba-1)阳性表达面积进一步降低(P<0.05)。与淫羊藿苷组比较，淫羊藿苷+抑制剂组小鼠M1型(CD11b/Iba-1)阳性表达面积升高(P<0.05)，M2型(CD206/Iba-1)阳性表达面积降低(P<0.05)(图2，表4)。

图1 小鼠海马组织尼氏及TUNEL染色Fig 1 Nissl and TUNEL staining of mouse hippocampus

2.5 淫羊藿苷对小鼠海马组织M1、M2型极化相关因子表达的影响

与对照组相比，模型组小鼠海马组织M1极化相关因子TNF-α、IL-1β蛋白表达升高(P<0.05)、M2型极化相关因子IL-10蛋白表达降低(P<0.05)。与模型组相比，淫羊藿苷组及PI3K激活剂组小鼠海马组织TNF-α、IL-1β蛋白表达降低(P<0.05)、IL-10蛋白表达升高(P<0.05)；PI3K抑制剂组小鼠TNF-α、IL-1β蛋白表达进一步升高(P<0.05)，IL-10蛋白表达进一步降低(P<0.05)。与淫羊藿苷组比较，淫羊藿苷+抑制剂组小鼠TNF-α、IL-1β蛋白表达升高(P<0.05)，IL-10蛋白表达降低(P<0.05)(图3，表5)。

red fluorescence for CD11b or CD206; green fluorescence for Iba-1图2 小鼠海马组织CD11b、CD206和Iba-1免疫荧光染色Fig 2 Immunorescence staining of CD11b, CD206 and Iba-1 in mouse hippocampus

表4 小鼠海马神经元CD11b/Iba-1和CD206/Iba-1阳性染色面积比较

2.6 淫羊藿苷对小鼠海马组织PI3K/Akt下游抗感染及抗凋亡蛋白表达的影响

与对照组相比，模型组小鼠海马组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β、Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)。与模型组相比，淫羊藿苷组及PI3K激活剂组小鼠p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β、Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05)；PI3K抑制剂组小鼠p-PI3K/PI3K、 p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β、 Bcl-2蛋白表达进一步降低(P<0.05)。

A.control; B.model; C.icariin; D.PI3K activator; E.PI3K inhibitor; F.icariin + inhibitor图3 小鼠海马组织中TNF-α、IL-1β和IL-10蛋白表达FIg 3 Expression of TNF-α, IL-1β and IL-10 proteins in mouse hippocampus

表5 小鼠海马组织TNF-α、IL-1β、IL-10蛋白表达比较

与淫羊藿苷组比较，淫羊藿苷+抑制剂组小鼠p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β、Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)(图4，表6)。

A.control; B.model; C.icariin; D.PI3K activator; E.PI3K inhibitor; F.icariin + inhibitor图4 小鼠海马组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β和Bcl-2蛋白表达Fig 4 Protein expression of p-PI3K/PI3K，p-Akt/ Akt, p-GSK-3β/GSK-3β and Bcl-2 in mouse hippocampus

3 讨论

本研究用七氟醚麻醉+剖腹探查术建立POCD动物模型后发现，在恐惧实验及Y型迷宫试验中，小鼠5 min内僵直时间及N臂停留时间缩短，预示出现认知能力及空间记忆能力降低现象，光镜下可见海马神经元核固缩、空泡化、丢失等损伤凋亡现象严重， 提示POCD模型造模成功。淫羊藿苷具有抗感染及神经保护作用，可通过上调BDNF改善精神分裂症大鼠认知功能障碍[12]。本研究发现，POCD小鼠经淫羊藿苷干预治疗后，血清炎性因子TNF-α、IL-1β降低而BDNF升高，海马神经元损伤及凋亡缓解，认知能力及空间记忆能力均得到改善，提示淫羊藿苷可明显改善POCD小鼠海马神经元损伤、凋亡及认知功能损伤。

POCD海马神经元损伤凋亡机制复杂，有研究发现，在麻醉及手术过程中，前炎性因子-钙结合蛋白salgranulin A(S100A8)表达的持续增加，使免疫受体Toll受体(TLR4)激活并刺激中枢神经系统的巨噬细胞-小胶质细胞活化，诱发神经炎性损伤及POCD的发生[13]。本研究在POCD小鼠海马组织中检测到TNF-α、IL-1β表达升高及IL-10表达降低，小胶质细胞M1型活化高于M2型活化，提示小胶质细胞M1型极化介导的促炎反应激活，可能是POCD神经元损伤及认知功能受损的关键机制之一。

PI3K/Akt在细胞存活及固有免疫细胞极化反应中起重要作用。PI3K活化后可通过多种途径调节下游靶蛋白表达来发挥抗凋亡作用。七氟醚处理小鼠后，海马组织PI3K/Akt通路磷酸化水平降低，海马神经元损伤、凋亡及认知功能损伤加重，并认为七氟醚对PI3K/Akt促细胞生存通路的抑制可能是诱发POCD发生的原因之一[14]。PI3K/Akt通路激活可促进巨噬细胞向M2型抗感染方向极化，缓解缺血再灌注肺损伤的发展[15]。本研究结果提示促进PI3K/Akt-GSK-3β通路磷酸化活化可能是提高小胶质细胞M2型极化介导的抗感染反应激活，改善POCD小鼠海马神经元损伤凋亡及认知功能损伤的关键机制。

表6 小鼠海马组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β、Bcl-2蛋白表达比较

淫羊藿苷组小鼠PI3K/Akt-GSK-3β通路处于磷酸化活性状态，M2型极化介导的抗感染反应明显高于M1型极化介导的促感染反应，小鼠海马神经元损伤凋亡及认知功能损伤作用得到明显改善，提示淫羊藿苷改善POCD小鼠海马神经元损伤凋亡及认知功能损伤作用。淫羊藿苷与PI3K抑制剂联用后，PI3K/Akt-GSK-3β通路活性降低，POCD小鼠海马神经元损伤凋亡及认知功能损伤较淫羊藿苷加重，提示PI3K抑制剂可削弱淫羊藿苷的促进PI3K/Akt-GSK-3β通路活化，改善POCD小鼠海马神经元损伤凋亡及认知功能损伤作用。

综上所述，淫羊藿苷改善POCD小鼠海马神经元损伤凋亡及认知功能损伤作用，可能与促进PI3K/Akt-GSK-3β磷酸化活化、提高M2型极化介导的抗感染反应激活有关。这为阐明淫羊藿苷抗认知功能损伤的分子生物学机制提供一定参考，并为淫羊藿苷在POCD领域的研究应用提供一定依据。