TDI联合血清miR-34a在CHD合并PAH患儿诊断中的应用

徐姗姗， 曹仙英， 周 彬

1. 上饶市立医院超声医学科， 江西 上饶 334000； 2. 上饶市立医院妇产科， 江西 上饶 334000

先天性心脏病(CHD)是新生儿中最常见的出生缺陷，可引起心力衰竭和肺动脉高压(PAH)，在我国具有较高的发病率[1,2]。如果不及时进行手术治疗，只有30%～40%的患儿能存活10年以上[3]。CHD患者一旦发生PAH，将进一步增加流向心脏的血流量，加重心脏负荷，可能导致心力衰竭或死亡。超声心动图是诊断CHD的常见影像学检查方法，传统的射血分数、短轴缩短率等心动图参数因无法反映患者的整体心室功能，因此临床中存在误诊或漏诊现象。组织多普勒成像(TDI)是从超声心动图衍生的新技术，也称组织多普勒超声心动图，该技术主要通过检测室壁运动速度和方向来判断心功能[4,5]。Tei指数是一项评价心室整体收缩和舒张功能的时间指标[6]，Z指数是一项评价心室整体功能的时间指标，Z指数弥补了Tei指数在评价心室整体功能中的不足[7]，有文献表明，TDI-Tei联合TDI-Z对CHD患儿心室整体功能具有良好的预测价值[8]。miRNAs是一类高度保守的非编码小RNA，在基因表达的转录后调控中发挥重要作用[9]，miRNAs参与许多生物学过程和疾病，包括先天性心脏病[10]。循环miRNAs在各种病理过程中具有潜在的生物标志物能力，包括心脏、心肌重构、心肌梗死和心力衰竭[11]，万楠等[12]曾经报道，外周血浆miR-324-5p诊断CHD的曲线下面积(AUC)为0.731，具有一定的诊断价值。microRNA-34a(miR-34a)是miRNAs的成员之一，属于肿瘤抑制因子的miR-34家族(miR-34a、miR-34b、miR-34c)，其在心肌组织中具有一定的特异性[13]。据文献报道，miR-34a在冠心病、心肌缺血、高血压、心力衰竭患者体内异常表达[14]。本研究考察了TDI参数(TDI-Tei和TDI-Z)联合血清miR-34a对CHD合并PAH患儿的诊断价值，旨在开发出提高CHD患儿早期诊断PAH的有效方案，以便尽早实施有效治疗。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究为前瞻性研究。选择2018年7月至2021年12月在我院确诊的112例CHD患儿为研究对象，其中，男66例、女46例；年龄3～13岁，平均年龄(8.36±3.15)岁。根据是否发生PAH将患儿分为CHD组(71例)和CHD+PAH组(41例)。纳入标准：CHD组患儿均被诊断为CHD，CHD+PAH组患儿均被诊断为CHD合并PAH，PAH是指肺动脉收缩压>35 mmHg；患儿具有完整的临床数据；患儿父母签署知情同意书。排除标准：患有其他恶性肿瘤、严重免疫系统疾病、肝肾功能障碍或肺部疾病的患儿；临床数据不完整的患儿。本研究获得医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1TDI-Tei和TDI-Z的测量

使用 GE vivid E90 超声诊断仪，采用 M5Sc探 头，进行TDI检查，探头频率为 1.4～ 4.6 MHz。所有患儿在安静状态下取仰卧位或左侧卧位行经胸超声心动图检查，同步描记标准II导联心电图。TDI模式的启动是在心尖标准四腔心切面下进行的，取样框置于三尖瓣与右室侧壁环交界处，取样容积为2～4 mm。启动脉冲TDI测量三尖瓣口血流频谱A峰终止处至下一个心动周期E峰开始处的时间，心底短轴切面录取右室射血时间。Tei指数是心室等容收缩时间与等容舒张时间之和与心室射血时间的比值[6]。Z指数是心室射血时间与舒张充盈时间之和与心电图R-R间期的比值[7]。连续测量3个心动周期取平均值计算TDI-Tei和TDI-Z。

1.2.2血清miR-34a的检测

所有患儿在入院后第2天抽取空腹静脉血5 mL，加入肝素抗凝，在4 ℃下1500×g离心5 min，取血清进行检测。通过qRT-PCR检测血清miR-34a。在血清中加入TRIzol试剂提取总RNA，用紫外分光光度计测RNA的纯度和浓度。使用SYBR-Green Real-time PCR Master Mix严格按照试剂盒的说明进行反转录。然后用PrimeScrip RT Master Mix Kit(TaKaRa)进行PCR扩增。扩增体系：10 μL SYBR qPCR Mix，上下游引物各0.8 μL，cDNA产物2 μL，ROX参考染料0.4 μL，用无核糖核酸酶水配制成20 μL。反应条件为：95 ℃预变性35 s，94 ℃变性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s。所有的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如下：miR-34a：正向5′-GTCCGCTGGCAGTGTCTTAGCT-3′和反向5′-GTGCGTGTTCGTGGAGTC-3′；U6：正向5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和反向5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6为内参，用2-ΔΔCt法计算相对表达量。

1.3 统计分析

IBM SPSS Statistics 21.0用于统计分析。分类变量使用例数(n)进行描述，组间比较采用χ2检验。使用Shapiro-WilkW检验连续变量数据分布的正态性。非正态分布的数据使用中位数和四分位间距进行描述，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。正态分布的数据使用带有标准差的平均值进行描述，组间比较采用t检验。通过使用Spearman相关系数分析TDI-Tei、TDI-Z和miR-34a之间的相关性。受试者操作特征(ROC)曲线分析用于确定TDI-Tei、TDI-Z和miR-34a对CHD合并PAH的诊断价值。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CHD组和CHD+PAH组患儿的临床资料比较

表1显示，两组患者的年龄、性别、疾病类型比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 患儿的临床资料

2.2 CHD组和CHD+PAH组患儿的TDI参数和血清miR-34a比较

表2显示，CHD组的TDI-Tei显著低于CHD+PAH组(P<0.001)。CHD组的TDI-Z显著高于CHD+PAH组(P<0.001)。CHD组的血清miR-34a相对表达量显著低于CHD+PAH组(P<0.001)。

表2 两组患儿的TDI参数和血清miR-34a水平

2.3 TDI-Tei、TDI-Z与血清miR-34a的相关性

相关性分析显示，TDI-Tei与TDI-Z呈负相关关系(r=-0.325，P<0.01)，TDI-Tei与血清miR-34a呈正相关关系(r=0.260，P<0.01)，TDI-Z与血清miR-34a呈负相关关系(r=-0.386，P<0.01)。见图1。

图1 TDI-Tei、TDI-Z与miR-34a的相关性散点图

2.4 TDI-Tei、TDI-Z和血清miR-34a诊断CHD合并PAH的价值

ROC曲线分析显示，TDI-Tei、TDI-Z和血清miR-34a联合诊断CHD合并PAH的AUC(0.923)和敏感性(87.80%)均高于各指标单独诊断，特异性为88.73%，仅低于miR-34a。见表3和图2。

表3 TDI-Tei、TDI-Z和血清miR-34a诊断CHD合并PAH的ROC曲线分析结果

图2 TDI-Tei、TDI-Z、血清miR-34a及三项联合诊断CHD合并PAH的ROC曲线

3 讨论

PAH是一种以肺血管重构和肺动脉压升高为主要特征的疾病，而CHD患者的心脏结构异常可导致PAH的发生。因此，CHD合并PAH是最常见的PAH类型之一。TDI是1989年首次描述的一种可重复使用的综合超声心动图技术，可以直接测量心肌和瓣膜环处的运动速度，对心肌运动进行准确和直接的定量评估[5,15]。在成人超声心动图中，这项技术有助于在临床前阶段早期识别细微的心功能障碍，并可作为主要心脏疾病，如心力衰竭、急性心肌梗死和高血压的预后工具[16]。例如，二尖瓣环血流速度峰值(PAV)、二尖瓣环与二尖瓣环舒张期血流速度之比(E/E′)和室内不同步现象，已被证明可以预测死亡率和心血管事件[17]。因此，笔者认为TDI可能是一种检测CHD患儿心脏功能障碍的敏感工具。目前，许多学者评估了TDI在患儿心功能检查中的应用[8,15]。虽然传统的超声心动图技术是基于血流的，但TDI使用超声波的频移来计算心肌速度，其特点是速度较低、幅度较高[18]，具有更低的负荷依赖性。据报道，TDI-Tei和TDI-Z可反映心室整体功能[6,7]。在本研究中，CHD患儿的TDI-Tei显著低于CHD合并PAH患儿，而TDI-Z显著高于CHD合并PAH患儿。相关性分析显示，TDI-Tei与TDI-Z显著负相关。Grapsa等[19]报道，PAH患者的右室TDI-Tei明显升高，并且与心脏损伤程度正相关。另外，Dyer等[20]报道，原发性PAH患儿的右室TDI-Tei与肺动脉压呈正相关，患儿治疗后TDI-Tei明显降低。陈图敏等[8]报道，TDI-Z随着左向右分流型CHD患儿的肺动脉收缩压增加而减低，且右心TDI-Tei与TDI-Z呈负相关，本研究结果与上述结果一致。

本研究考察了两项TDI参数诊断CHD合并PAH的价值。结果表明，单独诊断时，TDI-Tei诊断CHD合并PAH的敏感性低于TDI-Z，而特异性高于TDI-Z。分析其原因，可能是虽然与普通超声心动图参数相比，TDI-Tei在评价心功能中的价值更高，但是，当患者仅仅存在单纯性舒张功能不全时，TDI-Tei可能与正常人无明显差异[21]。而TDI-Z代表了整个心动周期中血液进出心室的百分比，只要舒张或收缩功能有一项发生障碍，则TDI-Z都会降低。这可能是诊断CHD合并PAH时，TDI-Tei敏感性低而TDI-Z特异性低的原因，因此TDI-Tei联合TDI-Z可弥补TDI-Tei评价心室整体功能中的不足。此外，TDI-Tei和TDI-Z均是时间间期的比值，因此可以消除年龄和心率的影响[22]，可能在婴幼儿中具有更高的应用价值。

由于早期CHD合并PAH没有典型的临床症状，因此，寻找一种特异的标志物对其诊断和治疗具有重要意义。有研究认为，miRNAs在PAH的发病机制中起重要作用，可参与调控血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的血管生成、增殖和凋亡[23]。本研究考察了血清miR-34a与PAH发生的关系，结果显示，CHD患儿的血清miR-34a相对表达量显著低于CHD合并PAH患儿。此外，ROC曲线分析显示，单独诊断时，血清miR-34a诊断CHD合并PAH的AUC和特异性均高于TDI-Tei和TDI-Z，说明血清miR-34a有望成为早期诊断CHD合并PAH的潜在生物标志物。一项关于CHD小鼠模型的实验研究显示，miR-34a通过下调Notch-1来增加CHD的发生风险[24]。Notch-1基因突变可导致主动脉瓣疾病，而主动脉瓣钙化是心脏病的第三大原因[25]，据报道，心内膜中Notch信号通路的突变会导致先天性结构畸形，这可能会导致成人和新生儿心脏疾病[26]。此外，Notch信号通路通过促进心肌再生、保护缺血心肌、诱导血管生成、同时负向调节心脏成纤维细胞的转化在心肌损伤的修复中发挥重要作用[27]。此外，miR-34a的上调可加剧内皮细胞炎症反应[28]，可诱导血管炎症、诱导心肌细胞凋亡并促进血管钙化[29,30]。因此，miR-34a可能通过调节心肌细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、炎症等机制来参与CHD合并PAH的进展。

本研究结果显示，TDI-Tei与血清miR-34a呈正相关关系，TDI-Z与血清miR-34a呈负相关关系。进一步研究证实，TDI-Tei、TDI-Z、血清miR-34a联合诊断CHD合并PAH患儿的AUC和敏感性高于单独诊断，特异性仅低于miR-34a单独诊断。因此，TDI联合血清miR-34a在诊断CHD合并PAH患儿中具有较高的价值，该联合诊断方法可有效降低临床中的漏诊和误诊情况，有望提高CHD患儿发生PAH的早期检出率，值得临床推广。