甘蔗发酵制品的氨基酸对比及营养风味分析

林 波，郑凤锦，方晓纯，陈赶林

（1.广西农业科学院农产品加工研究所，广西 南宁 530007；2.广西果蔬贮藏与加工新技术重点实验室，广西 南宁 530007）

甘蔗为广西重要的经济作物，亦是传统支柱产业。甘蔗因其含糖分高，且富含绿原酸、咖啡酸等酚酸类物质，以及多种氨基酸、维生素、钙、铁、微量元素等营养成分[1-2]。甘蔗性平，具有清热润肺、健入肝脾、生津解酒、止咳消痰等功效，是“天然复脉汤”或“补血果”[3]。经现代学者对甘蔗的茎、叶、汁进行相关研究，证实甘蔗具有较强的抗炎、抗氧化、抗突变、降血糖、正向调节血脂水平等功效[2，4-6]。甘蔗汁糖分丰富，经发酵加工后可制备果酒[7]、果醋[8]、功能饮料[9]等，不仅拓宽了甘蔗深加工多样化产品开发，还丰富了果酒、果醋的品种类型，甘蔗深加工成为了国内外近年来加工研究的热点。

随着国民经济和人民生活水平的提高，酒类产品趋于低度化、营养型，果醋产品兼具营养、保健性能，已成为产业政策、市场需求及与国际接轨的必然发展趋势。据报道[10]，2020年上半年，在淘宝、天猫、酒仙网等电商平台，果酒的销售额达3.243亿元，同比增长1 944.6%；中国低度酒市场到2035年或将超过2 500亿元。氨基酸是酒、醋中重要的营养与呈味物质，与原料中的糖类、有机酸和挥发性成分协同赋予了特殊的味感（如酸、甜、苦、鲜、涩）；而氨基酸的种类及浓度对果酒、果醋香气的复杂性有直接的影响[11]，其中氨基酸对食醋的酸味具有缓冲作用，使其更加柔和、鲜美、醇厚[12]。因此，阐明发酵产品的氨基酸组成差异及呈味分析，对于指导发酵产品的开发具有重要的现实意义。

课题组前期研究对（低度）甘蔗果酒、甘蔗醋的发酵工艺及发酵风味进行优化[7-8，13]。以甘蔗混合汁为原料，采用甘蔗低度酒、甘蔗醋的工艺发酵制备得到甘蔗果酒、甘蔗醋，对甘蔗发酵制品中氨基酸的变化进行分析，通过分析甘蔗汁、甘蔗果酒、甘蔗醋中氨基酸总量、必需氨基酸、呈味氨基酸等组成及含量，根据氨基酸平衡理论，采用氨基酸比值系数法综合评价甘蔗发酵制品的营养价值，为甘蔗多样化产品开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

原料：甘蔗汁、甘蔗果酒、甘蔗醋，广西农业科学院农产品加工研究所制备提供。

试剂：盐酸、苯酚、柠檬酸钠、氢氧化钠、茚三酮等，优级纯；超纯水，自制。

氨基酸的进口标准品（Wako）：门冬氨酸（L-Aspartic Acid）、苏氨酸（L-Threonine）、丝氨酸(L-Serine）、谷氨酸（L-Glutamic Acid）、脯氨酸（L-Proline）、甘氨酸（Glycine）、丙氨酸（L-Alanine）、胱氨酸(L-Cystine）、缬氨酸(L-Valine）、蛋氨酸（L-Methionine）、异亮氨酸（L-Isoleucine）、亮氨酸（L-leucin）、酪氨酸（L-Tyrosine）、苯丙氨酸（L-Phenylalanine）、赖 氨 酸(L-Lysine）、组 氨 酸（L-Histidine）、精氨酸（L-Arginine），混合标准溶液，北京世纪奥科生物技术有限公司提供。

仪器：L-8900型全自动氨基酸分析仪、磺酸型阳离子树脂分离柱（4.6 mm ID×60 mm，3 μm），日本HITACHI公司产品；GR-202型分析天平，日本A&D有限公司产品；CAHT-50L型超纯水器，北京中科智恒科技有限公司产品；GM-0.5A型隔膜真空泵，天津津腾实验设备有限公司产品；D3500S-DTH型超声波清洗器，必能信超生（上海）有限公司产品；VORTEX GENIUS 3型涡旋振荡器，德国IKA公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 氨基酸组成测定

参照GB/T 5009.124—2016食品中氨基酸的测定方法，吸取样品2.000 g进行酸水解，水解后的溶液过0.22 μm滤膜，所得滤液进行氨基酸分析，每个样品平行3次。

（1）标准溶液制备。准确吸取0.4 mL（精确至0.001 mL）氨基酸的混合标准品，以0.1 mol/L盐酸溶液定容至10 mL，制得0.1 μmol/mL混合标准工作液，现用现配。

（2）色谱条件。色谱柱为磺酸型阳离子树脂分离柱，4.6 mm ID×60 mm，3 μm；缓冲液流速0.40 mL/min；显色剂溶液流速0.35 mL/min；检测波长570 nm，440 nm；分离柱温度59℃；反应温度135℃；进样量20 μL；最低检测灵敏度3 pmol；适宜样品浓度2 nmol/20 μL。

1.2.2 营养评价

根据氨基酸比值系数法[14]，将甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋中的氨基酸组成，与1973年联合国粮农组织（FAO）/世界卫生组织（WHO）/提出的人体必需氨基酸模式进行对比，通过公式（1）～（3）计算样品中必需氨基酸（EAA）的氨基酸比值（RAA）、氨基酸比值系数（RC）和氨基酸比值系数分（SRC）。

式中：待评价蛋白质某必需氨基酸含量与WHO/FAO模式中相应必需氨基酸含量均以1 g蛋白质中的量计，mg/g；

RAA——样品中某种必需氨基酸的含量相当于模式中相应必需氨基酸的多少倍。

式中：RC=1——该种必需氨基酸的含量比例与模式氨基酸一致；

RC＞1——该种必需氨基酸的含量相对过剩；

RC＜1——该种必需氨基酸的含量相对不足。其中，RC值最低者为第一限制性氨基酸（FLAA）。

式中：CV——RC的相对标准偏差。SRC的意义：如果蛋白质中必需氨基酸的组成比例与必需氨基酸模式一致，则CV=0，SRC=100；若蛋白质的RC值越分散，那么这些必需氨基酸在氨基酸平衡生理作用方面所提供的负作用越大，则CV值变大，SRC值变小，蛋白质的营养价值越差。相比较而言，SRC值越接近100，其营养价值越高[15]。

1.2.3 风味氨基酸及滋味强度

（1）风味氨基酸组成。食品中影响风味的氨基酸主要分为鲜味和酸味氨基酸（Sour and MSG-like Amino Acids，SMAA）、甜味氨基酸（Sweet Amino Acids，SAA）和苦味氨基酸（Bitter Amino Acids，BAA）三大类[16]。其中，鲜味和酸味氨基酸以谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）含量之和计。甜味氨基酸：以苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）之和计。苦味氨基酸：缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）、组氨酸（His）之和计。

（2）滋味强度值。滋味物质的味道强度值[17]（Taste Activity Value，TAV）的计算公式如下：

式中：TAV——味道强度值；

C——滋味物质的绝对浓度值，mg/100 g；

T——滋味物质的阈值，mg/100 g。

通常认为，TAV值大于1时，该物质能够对该样品的呈味有贡献，且数值越大，贡献越大；相反，当比值小于1时，说明该物质对呈味贡献不大，呈味作用不显著。

1.3 数据处理

采用Microsoft Office Excel 2016软件进行数据整理和绘图，IBM SPSS 23.0统计分析软件进行显著性方差分析，采用Duncan检验方法（p＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 甘蔗发酵制品氨基酸成分变化分析

甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋中游离氨基酸组成及质量浓度见表1。

由表1可知，甘蔗汁的总氨基酸（TAA）最高，其次是甘蔗果酒，甘蔗醋最低；而必需氨基酸质量浓度最高是甘蔗果酒，其次是甘蔗醋，最少是甘蔗汁，其中甘蔗果酒、甘蔗醋的必需氨基酸（EAA）占总氨基酸（TAA）分别是43.58%，43.53%，高于FAO/WTO标准蛋白的必需氨基酸含量36.0%。非必需氨基酸（NEAA）含量最高是甘蔗汁，占总氨基酸的20.23%，而甘蔗果酒、甘蔗醋含量依次较低，分别占总氨基酸的77.26%，77.08%，超过FAO/WHO提出的氨基酸模式60%以上。根据食品风味氨基酸的分类及含量结果，甘蔗汁的主要风味氨基酸是鲜味氨基酸（SMAA），其质量浓度最高为487.30 mg/100 mL（p＜0.05），其次是苦味氨基酸（BAA）和甜味氨基酸（SAA）；甘蔗果酒和甘蔗醋的主要风味氨基酸是苦味氨基酸（BAA），甜味氨基酸次之，鲜味氨基酸相对较少。

表1 甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋中游离氨基酸组成及质量浓度/mg·（100 mL）-1

甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋的17种氨基酸对比见图1。

由图1可知，分别对甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋的17种氨基酸进行百分比对比。甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋中主要的氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸，分别占甘蔗汁总氨基酸的58.9%，10.4%，占甘蔗果酒总氨基酸的11.4%，10.3%和占甘蔗醋总氨基酸的12.3%，10.5%，其他的氨基酸分别占甘蔗汁的1.0%～3.0%，占甘蔗果酒的3.0～6.0%，占甘蔗醋的2.0%～6.0%。

图1 甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋的17种氨基酸对比

甘蔗汁经酒精发酵制备的甘蔗果酒，其所含氨基酸中除了天冬氨酸、谷氨酸和蛋氨酸的含量显著降低外，大部分含量都比甘蔗汁中的有不同程度增加，尤其是酪氨酸、赖氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸含量明显增加。

这与甘蔗汁在酒精发酵过程中，酿酒酵母利用甘蔗汁中的糖源和氨基酸合成结构性和功能性蛋白质，用来生长酵母菌体及合成酶类，也作为酵母所需的氮源供给[18]，随着甘蔗汁酒精发酵，甘蔗汁中的蔗糖受热水解成葡萄糖和果糖。葡萄糖经酶类催化、戊糖磷酸途径、糖酵解途径代谢生成组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、丝氨酸、胱氨酸和甘氨酸；随着甘蔗汁中葡萄糖继续分解生成的丙酮酸，与谷氨酸在生物酶的作用下合成丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸；天冬氨酸和谷氨酸作为微生物发酵中主要的生物合成氨基酸，氨基酸进入柠檬酸（三羧酸）循环代谢[19]，天冬氨酸经参与发酵代谢活动后，其含量明显降低。作为必需氨基酸之一的赖氨酸，其生物合成起源于α-酮戊二酸，在发酵中与苏氨酸有相互竞争抑制的作用；由于甘蔗汁中含有苏氨酸，参与酿酒酵母的代谢活动较少，从而提高甘蔗果酒中α-酮戊二酸合成赖氨酸的含量[20]。与报道的果酒发酵中各类氨基酸含量的变化趋势有所不同，这可能与原果中所含有的糖原有关系[21]。因此，甘蔗汁发酵成甘蔗果酒的总氨基酸及其天冬氨基酸的含量明显降低，其他氨基酸种类及含量呈现不同程度的增加或降低的变化。

而甘蔗醋在酒用酵母和醋酸菌的先后作用下进行发酵，所得的醋液同比甘蔗汁，其氨基酸中天冬氨酸、谷氨酸和蛋氨酸的含量降低，同时脯氨酸和丝氨酸含量也有少许降低；其他氨基酸的含量提高了10%～80%，如甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸。这与山西老陈醋经发酵后各氨基酸有不同程度的增加变化结果一致，各类氨基酸参与醋酸发酵代谢活动，而且甘蔗醋中的氨基酸含量的增加主要来源于酒精发酵[22]。研究发现，不同的微生物分类群与不同的氨基酸化合物具有相关性[23]。

2.2 甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋的营养成分评价

采用氨基酸的组成比值系数法对比甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋的各种必需氨基酸营养成分变化，并进行营养评价。

甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋中必需氨基酸占总氨基酸的质量分数见表2，甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋中必需氨基酸的RAA、RC和SRC的比较见表3。

表2 甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋中必需氨基酸占总氨基酸的质量分数

表3 甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋中必需氨基酸的RAA、RC和SRC的比较

由表2可知，通过与FAO/WHO的理想蛋白质人体必需氨基酸的模式谱进行比较，甘蔗果酒和甘蔗醋的必需氨基酸组成中异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸、苏氨酸、缬氨酸都高于FAO/WHO的模式谱，其中甘蔗果酒中赖氨酸比值比FAO/WHO的模式谱高达4.21%，甘蔗醋中缬氨酸比FAO/WHO的模式谱高出1.94%，甘蔗果酒和甘蔗醋的蛋氨酸+半胱氨酸占比均低于WHO/FAO模式谱，甘蔗果酒和甘蔗醋的必需氨基酸占总氨基酸比值都相差不多；而甘蔗汁的必需氨基酸占比均低于WHO/FAO模式谱。这可能与甘蔗在酒精发酵、醋酸发酵过程中，酵母利用甘蔗汁中的糖原、蛋白质等成分进行生物代谢产物或发酵完全后酵母细胞自溶有密切联系[20]。这与软枣猕猴桃的鲜果、果酒的营养评价结果类似[24]，果酒的营养价值比原果汁的要高些。

由表3可知，蛋氨酸+半胱氨酸是甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋的第一限制性氨基酸。甘蔗汁的苏氨酸RC值最高，且与异亮氨酸、缬氨酸均符合WHO/FAO参考氨基酸模式；甘蔗果酒和甘蔗醋中赖氨酸RC值高，且与异亮氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸、苏氨酸、缬氨酸符合WHO/FAO参考氨基酸模式，亮氨酸略低于WHO/FAO参考氨基酸模式。从氨基酸比值系数分（SRC）来看，甘蔗汁的SRC最高（69.66），比甘蔗果酒、甘蔗醋的SRC约高出10.0，说明甘蔗汁的营养价值比甘蔗果酒、甘蔗醋要高，但从必需氨基酸的配比上看，甘蔗果酒和甘蔗醋的配比更趋于合理，如赖氨酸是组成人体蛋白质的必需氨基酸之一，必须从食物中摄取补充，在加工过程中极易被破坏[25]，但从甘蔗汁发酵制备成甘蔗果酒、甘蔗醋，其赖氨酸的RC均比甘蔗汁的RC高，这说明通过发酵加工，甘蔗汁发酵制备的甘蔗果酒、甘蔗醋必需氨基酸营养更均衡，具有一定的营养食用价值。

2.3 甘蔗制品呈味强度分析

根据风味氨基酸的分类方法，将各类风味氨基酸对照其在水中的呈味阈值计算出各自的TAV值。

甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋中氨基酸的呈味分析见表4。

表4 甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋中氨基酸的呈味分析

由表4可知，甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋的呈味分布不一，甘蔗汁的主要呈味分布是鲜味氨基酸＞苦味氨基酸＞甜味氨基酸；甘蔗果酒和甘蔗醋的呈味分布是苦味氨基酸＞鲜味氨基酸＞甜味氨基酸。甘蔗汁中对滋味物质有贡献的氨基酸种类有2种，TAV值最高的为天冬氨基酸（4.14），其次是谷氨酸（2.44）；甘蔗果酒中滋味物质有贡献的氨基酸也有2种，TAV值最高的为谷氨酸（1.86），其次是赖氨酸（1.05）；甘蔗醋中滋味物质有贡献的氨基酸只有1种，为谷氨酸（1.28）。谷氨酸在甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋的TAV值中均为较高值，说明是这三者的主要滋味贡献氨基酸。

氨基酸分类中苦味氨基酸种类最多，甜味氨基酸其次，鲜味氨基酸种类最少[26]。但是，甘蔗汁和甘蔗醋中鲜有苦味感，因苦味氨基酸如苯丙氨酸、异亮氨酸等，当其含量低于呈味阈值时，可增强其他呈味氨基酸的鲜味和甜味，如苦味氨基酸精氨酸，有增加呈味复杂性和提高鲜度的作用[27]。

3 结论

以甘蔗混合汁为原料，经酒精发酵和醋酸发酵制备甘蔗果酒、甘蔗醋制品。通过对甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋中氨基酸进行对比分析与评价。甘蔗汁中氨基酸含量丰富，总氨基酸最高，必需氨基酸所占比例较少；甘蔗果酒、甘蔗醋的总氨基酸有所减少，但必需氨基酸所占比值较高，且都高于FAO/WHO的模式谱。蛋氨酸和半胱氨酸是甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋的第一限制性氨基酸。甘蔗汁的SRC最高，明显比甘蔗果酒、甘蔗醋的SRC高；而甘蔗果酒、甘蔗醋，其赖氨酸的RC均比甘蔗汁的RC高；综合从必需氨基酸的配比考虑，甘蔗果酒和甘蔗醋的更趋于合理，可与其他饮品搭配调制食用或开发新产品，提高产品中营养生物效价。

甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋的呈味氨基酸分布不一，甘蔗汁的主要呈味分布是鲜味氨基酸＞苦味氨基酸＞甜味氨基酸，甘蔗果酒和甘蔗醋的呈味分布是苦味氨基酸＞鲜味氨基酸＞甜味氨基酸。谷氨酸是甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋的主要滋味贡献氨基酸，TAV在1.3～2.4。

研究在前期果酒、果醋研究的基础上，从产品的氨基酸组成及其营养价值和呈味上分析，初步探索甘蔗果酒、甘蔗醋的必需氨基酸营养组成，具有一定的营养价值。由于是从氨基酸的组成及含量对产品的呈味进行分析，但氨基酸对酒、醋发酵的微生物群落演替及风味差异的影响尚不明确，还需进一步进行研究。研究结果可为甘蔗多样化产品开发，以及产品营养与特征风味提供理论依据，并为果酒、果醋研究营养成分与微生物群落特征相关基础。