鱼油通过调节炎症反应及氧化应激改善糖尿病大鼠认知障碍

周玉兰 冀俊林 池兴旺

(天津市东丽医院神经内科，天津 300300)

2型糖尿病(T2DM)是一种与年龄相关的代谢性疾病。大量流行病学数据显示〔1，2〕，T2DM患者认知功能障碍的风险较非糖尿病患者增加一倍，T2DM可能加速认知功能障碍。然而，T2DM认知功能障碍发病机制仍是未知的。影像学研究发现，糖尿病患者的大脑结构异常，可能加速认知能力的下降〔3，4〕。糖尿病大鼠模型实验发现〔5〕，光学显微镜观察海马神经元数量明显减少，海马神经元形态异常。研究表明，神经炎症和氧化应激可能是糖尿病认知功能障碍发生的关键因素〔6，7〕。一旦这些危险因素被激活，糖尿病患者的认知功能将很快下降，最终导致痴呆，这将极大地影响患者的生活质量，给患者和社会带来巨大负担。目前没有有效的药物可以预防或减缓糖尿病患者认知功能障碍的发生及进展。因此，开发有效的药物预防或延缓糖尿病的认知障碍对人们来说是一个挑战。

鱼油是一种天然保健品，由海鱼的脂肪精制而成，富含ω-单不饱和脂肪酸。海鱼油含有4种长碳链多不饱和脂肪酸，包括花生四烯酸(AA)，二十碳五烯酸(EPA)，二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。鱼油中的这4种长链脂肪酸EPA和DHA的含量较高，对人体健康有益。鱼油具有增强免疫力〔8〕、预防类风湿关节炎〔9〕、预防脂肪肝〔10〕和抑制癌症〔11〕的作用。另有研究表明〔12〕，鱼油可能是预防和治疗糖尿病和抑制痴呆的潜在药物。为了解鱼油如何预防糖尿病的认知障碍，本研究建立糖尿病动物模型来探索其机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 30只成年雄性SD大鼠(160～180 g)由华北理工大学实验动物中心提供。 动物处在受控温度(22±2)℃和12∶12 h光/暗循环。 大鼠均按照实验室动物指南的护理和使用进行实验。大鼠高脂饮食(10%胆固醇10 ml/kg)2 w。 禁食过夜后，给大鼠腹腔注射40 mg/kg链脲佐菌素(STZ)。 对照组注射生理盐水。 在高脂肪饮食之前，将所有动物分成3组：对照组(n=10)和糖尿病组(n=10)，标准大鼠饲料喂养。糖尿病+鱼油组(n=10)喂食含有4%鱼油，持续喂养8 w。STZ给药后72 h，血糖≥16.7 mmol/L的大鼠作为糖尿病模型。

1.2方法

1.2.1Morris水迷宫检测 在鱼油治疗后8 w，使用Morris水迷宫(上海欣软信息科技有限公司)评估大鼠的学习和记忆能力。 在第52天，对所有动物进行定位航行试验并持续4 d。 训练大鼠寻找隐藏在水面下2 cm处的平台，寻找和平台所花费的时间被记录为逃避潜伏期。 如果大鼠在60 s内未能找到平台，则将其引置平台上并使其保持10 s，逃避潜伏期记录为60 s。 在第56天，移除隐藏的平台，进行空间探索试验以评估大鼠的空间记忆，给予大鼠60 s在池中自由游泳。 记录目标象限中的大鼠所花费的时间，越过平台的次数及游泳速度。

1.2.2组织病理学检查 行为学检测结束后，通过苏木素-伊红(HE)染色检测海马CA1区的形态学改变。戊巴比妥钠(上海榕柏生物技术有限公司，货号：37612；60 mg/kg)麻醉大鼠，200～300 ml 4%多聚甲醛(碧云天，P0099-100 ml)进行心脏灌注。 收集组织并后固定，包埋。 将石蜡组织块切成5 μm厚的切片用于HE染色。 通过光学显微镜(奥林巴斯CX23)观察海马神经元形态。

1.2.3酶联免疫吸附试验(ELISA)测定组织匀浆中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6和IL-1β浓度 ELISA测定大鼠海马组织中TNF-α(ab100785)，IL-1β(ab9722)和IL-6(234570)浓度〔22〕。 TNF-α、IL-1β和IL-6的ELISA试剂盒购自Abcam公司。步骤均按照制造商的说明进行。 测定的海马TNF-α，IL-1β和IL-6浓度的结果以pg/ml表示。

1.3海马中过氧化物水平测定 将海马的组织匀浆用于细胞因子测定。 使用脂质过氧化物(MDA)测定试剂盒(A003-1-2)和过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒(A007-1-1；南京建成生物工程研究所，中国)分别评估MDA水平和CAT活性。 所有程序遵循制造商的说明。

1.4统计学处理 采用SPSS25.0软件和Sigma Plot10软件进行单因素方差分析(ANOVA)。

2 结 果

2.1鱼油对实验动物认知能力的改善 各组间游泳速度没有明显差异(P>0.05)。在定向巡航试验中，糖尿病组比对照组花费更多时间寻找隐藏平台；糖尿病明显降低了糖尿病大鼠逃避潜伏期(P<0.05)。在空间探索测试中，糖尿病组穿越平台象限的次数明显少于对照组(P<0.05)；在鱼油治疗后，糖尿病大鼠穿越平台象限的次数显著增加(P<0.05)。见表1。

2.2鱼油改善海马神经元形态 在对照组中观察到很少的异常神经元。在糖尿病组中，观察到神经元混乱无序，染色模糊，数量减少。鱼油治疗缓解了上述异常的形态变化。见图1。

2.3鱼油抑制糖尿病诱导的神经炎症 在糖尿病组海马中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平显著高于对照组(P<0.05)；糖尿病+鱼油组海马中炎症因子水平较糖尿病组显著降低(P<0.05)。见表1。

2.4鱼油对氧化应激标志物的影响 与对照组相比，糖尿病组海马MDA水平显著升高，CTA活性明显降低(P<0.05)；糖尿病+鱼油组海马中的MDA活性较糖尿病组明显降低，CAT活性明显升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组逃避潜伏期、穿台次数、游泳速度及海马IL-1β、IL-6、TNF-α水平和MDA、CAT活性比较

3 讨 论

T2DM是一种与年龄有关的全球范围内流行的代谢性疾病。T2DM与认知障碍和痴呆有关，T2DM患者罹患阿尔茨海默病(AD)的风险明显高于非糖尿病患者。 T2DM引起神经退行性疾病的机制仍不清楚，缺乏有效的药物来预防或延缓疾病的进展。因此，寻找有效的治疗方法或开发新的药物来对抗糖尿病的认知障碍非常必要。

鱼油改善了糖尿病大鼠的行为异常，并伴随着海马神经元的恢复，而神经元是负责学习和记忆的大脑区域。此外，本研究结果还表明，鱼油的神经保护作用与减轻炎症细胞因子和氧化应激有关。

大鼠持续性高血糖可能导致其行为异常，鱼油可逆转糖尿病引起的空间学习和记忆障碍。这与以前的研究相似〔13〕，报道补充了鱼油可以通过抑制STZ-糖尿病大鼠的神经元凋亡来帮助影响记忆和学习能力。

据推测，促炎细胞因子的堆积会触发神经炎症，通过诱导活性氧(ROS)产生并降低抗氧化剂的水平而导致氧化应激〔14〕。本研究结果与先前的发现一致。据报道，强烈的免疫原性反应和氧化应激可能进一步引起神经元损伤〔15〕。 本研究结果表明，糖尿病大鼠中神经元的损伤与促炎性细胞因子和氧化应激密切相关。鱼油减轻了糖尿病引起的脑损伤。鱼油可以减少促炎因子的表达，从而抑制肝脏和其他组织的免疫原性反应。ω-3脂肪酸DHA是鱼油中的活性成分之一，能够通过抑制STZ糖尿病大鼠的海马神经元凋亡来降低AD的风险并改善症状并增强学习功能。因此，本文初步确定鱼油通过抑制促炎因子的表达从而抑制免疫原性反应和氧化应激而达到神经保护作用。但本研究的样本量较小，且干预时间短，在后续研究中，应加大样本量，延长干预时间，并将从RNA 水平探讨促炎因子的表达，进一步完善鱼油改善糖尿病认知功能障碍大鼠的机制。