水飞蓟素通过JAK/STAT信号通路抑制老年非酒精性脂肪肝大鼠肝细胞增殖

李鑫 王文川 殷建敏 张清格 李保义 冯子峰 岳亚光

(邢台市人民医院 1中西医结合肝病科 ，河北 邢台 054001；2超声科；3邢台市爱尔眩晕耳鸣耳聋研究所；4邢台市人民医院消化内科)

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是不存在显著酒精消耗的前提下慢性肝病的一个主要原因，从良性脂肪蓄积、不同程度的肝脏炎症(肝炎)、进行性纤维化，并最终发展为肝硬化和终末期肝病甚至肝癌〔1〕，并且常常与胰岛素抵抗、向心性肥胖、2型糖尿病和血脂异常密切相关〔2,3〕。由于这些并发症的流行，NAFLD被公认是世界范围内的主要健康问题，并且是西方国家肝脏疾病的主要原因，其患病率高达33%〔4〕。与此同时，在东部国家，NAFLD患病率也在增加，这间接反映了这些地区肥胖症和与肥胖相关疾病的发生率在不断上升〔5〕。迄今为止，饮食调整和增加体育锻炼的结合仍然是NAFLD管理的主要方式〔6〕。然而不幸的是，从长期来看，许多患者尤其是老年患者难以改变生活方式。所以探索新的治疗老年NAFLD的方法及充分理解现存NAFLD药物对老年患者的病理机制是当下科研界亟待解决的难题。

水飞蓟素(silymarin)是从水飞蓟植物的干燥种子和果实中提取的化合物，主要成分为黄酮木聚糖，类黄酮(紫杉醇，槲皮素)和多酚〔7〕，可以清除自由基和抑制脂质过氧化，是一种天然抗氧化剂〔8〕。silymarin通过降低氧化应激反应和随之而来的细胞毒性，可以保护完整的肝细胞或尚未受到不可逆损伤的细胞，因此被认为具有肝保护作用〔9〕。研究显示，在大鼠NAFLD形成的过程中伴随肝细胞增生〔10〕，而细胞无限增生是最终导致癌症的罪魁祸首。silymarin早在癌细胞中就表现出抗增殖活性的作用〔11〕，然而尚无研究报道其在NAFLD模型中具有抗增殖活性的作用。因此本研究旨在探究silymarin对老年NAFLD大鼠肝细胞增殖的抑制作用。Janus激酶(JAK)和信号传导及转录激活蛋白(STATs)信号通路对于细胞增殖、凋亡，胚胎发育，肝脏再生，糖酵解和炎症反应，上皮间质转化及血管生成异常重要〔12〕。STAT3是一种转录因子，在细胞的生存、增殖和迁移中起着重要作用，因此被认为是抗细胞增殖相关的治疗靶点〔13〕。尽管JAK/STAT信号通路在细胞增殖中发挥了重要作用，但尚无研究指出silymarin是否通过JAK/STAT信号通路影响NAFLD肝细胞的增殖。本研究拟通过建立老年大鼠NAFLD模型，探讨 silymarin对NAFLD大鼠肝细胞增殖的影响及是否引起JAK/STAT信号通路的改变，进一步揭示silymarin治疗NAFLD疾病的机制。

1 材料和方法

1.1大鼠NAFLD模型的制备 45只清洁级老年雄性SD大鼠(7～8个月，680～720 g)。将大鼠随机分为3组(n=15)：对照(control)组、模型(NAFLD)组、silymarin组，分别喂养基础饲料、高脂饲料(含基础饲料77%、猪油20%、胆固醇1%、胆盐2%)；从第8周开始，silymarin组在给予高脂饲料的基础上腹腔注射给药silymarin 30 mg/kg，1次/d，连续给药12 w。试验结束时，颈总动脉放血处死大鼠，取血清和肝脏组织，备用。

1.2组织学分析 取合适大小的肝组织在甲醛溶液中固定48 h，包埋在石蜡中，制成4 μm厚度的石蜡切片。用苏木素-伊红(HE)进行染色，光学显微镜观察肝脏组织病理改变。

1.3血清生化指标水平测定 试验结束后，大鼠禁食12 h，颈总动脉取血，4 000 r/min离心15 min取上清，通过相应的检测试剂盒按照按说明书操作对大鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、三酰甘油(TG)和总胆固醇(TC)水平进行检测。

1.4肝细胞提取 取肝脏组织，切下适当大小的肝组织块，剪去包膜，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，剪碎，PBS清洗。加入消化液于4℃冰箱消化组织，次日，加入含有胎牛血清的RPMI1640培养基终止消化。使用筛网过滤细胞，1 000 r/min 离心5 min，沉淀收集于RPMI1640 培养液(含15%胎牛血清、100 U/L青霉素钠盐及100 mg/L硫酸链霉素)中培养。

1.5细胞增殖的测定 制备细胞悬液。检测细胞增殖活力，操作步骤按照CCK-8试剂盒说明书进行。细胞按70%～80%浓度铺于96孔板，待细胞完全贴壁后，每孔加入CCK8 试剂10 μl，置于细胞培养箱孵育3 h，分别于24、48、72 h 时间点用酶标仪检测其OD450值。

1.6细胞克隆形成实验 将适量细胞接种在6孔板，在CO2孵箱中孵育2 w，培养至合适浓度之后，用PBS洗涤2次，用0.5%结晶紫染色。在显微镜下计数形成的细胞菌落数，克隆形成效率=(菌落数/接种的细胞数)×100%。

1.7qRT-PCR检测相关基因mRNA水平变化

1.7.1细胞总RNA的提取 各组大鼠肝细胞于细胞培养瓶培养至80%密度后，收集细胞，加入Trizol试剂(Invitrogen)提取细胞总RNA，用NanoDrop ND-2000进行定量，检测总RNA的质量和浓度。

1.7.2逆转录 向1.5 ml EP管中加入500 ng/μg模板RNA，加入逆转录酶利用随机引物合成cDNA，逆转录的反应条件为：25℃ 10 min，50℃ 45 min，85℃ 5 min。

1.7.3qRT-PCR qRT-PCR体系共20 μl含cDNA模板1 μl，SYBR-green 10 μl，Primer mix 8 μl，DEPC 水1 μl，利用SYBR Green PCR试剂盒，加入细胞周期蛋白(Cyclin)D1特异性引物定量其mRNA的表达水平，引物序列如下：上游引物：GAPDH:上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；CyclinD1:上游引物：5′-GCGTACCCTGACACCAATCTC-3′，下游：5′-CTCCTCTTCGCACTTCTGCTC-3′。通过7500-Fast实时PCR系统上机检测。反应条件为：95℃ 5 min，然后在95℃ 10 s和60℃ 30 s进行40个循环。利用ΔΔCt法进行结果分析。

1.8Western印迹分析相关蛋白水平 使用放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液裂解细胞，充分震荡并刮取细胞，超声破碎细胞，12 000 r /min、4℃离心10 min后收集上清液，二喹啉甲酸(BCA)法测量蛋白浓度。取30 μg蛋白溶液，加入适量上样缓冲液，沸水煮沸5 min，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电泳结束后将凝胶中的蛋白转入聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%的脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗抗体4℃孵育过夜。次日，TBST洗涤之后，使用辣根过氧化物酶(HRP)标记的特异性二抗常温孵育1 h，加入电化学发光(ECL)试剂避光显影。

1.9统计学分析 采用SPSS22.0和GraphPad Prism7.0软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1肝脏组织病理学检测结果 control组肝脏组织正常，肝细胞规则排列，而NAFLD组肝脏组织出现典型的脂肪变性，肝细胞膨胀，大量脂肪空泡形成，伴有轻度至中度炎症浸润。Silymarin组肝脏病变程度较NAFLD组有明显好转。见图1。

图1 各组肝脏组织(HE染色，×40)

2.2各组血清生化指标水平比较 NAFLD组血清ALT、AST、TG、TC水平明显高于control组(P<0.05)；与NAFLD组相比，silymarin组上述指标明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组血清生化指标水平比较

2.3肝细胞增殖检测结果 与control组相比，NAFLD组48 h后肝细胞增殖活性明显升高；与NAFLD组相比，silymarin组48 h后肝细胞增殖活性明显降低(P<0.05)。见表2。与control组相比，NAFLD组肝细胞集落数目、CyclinD1 mRNA和蛋白水平均显著增加(P<0.05)；与NAFLD组相比，silymarin组细胞集落数目、CyclinD1 mRNA和蛋白水平均显著降低(P<0.05)。见表3、图2、图3。

表2 各组肝细胞活力检测结果

表3 各组细胞集落数目及CyclinD1 mRNA蛋白表达

图2 各组细胞克隆形成实验

图3 Western印迹检测各组CyclinD1蛋白

2.4肝细胞JAK/STAT通路水平变化 NAFLD组与control组肝脏组织JAK2、STAT3蛋白表达无明显变化(P>0.05)；NAFLD组p-JAK2、p-STAT3蛋白表达均明显高于control组(P<0.05)，silymarin能明显抑制p-JAK2、p-STAT3蛋白水平的升高(P<0.05)。见图4、表4。

图4 各组肝细胞JAK2、STAT3蛋白及磷酸化表达

表4 各组肝细胞JAK2、STAT3蛋白及磷酸化表达变化

3 讨 论

NAFLD是代谢综合征的肝脏表现〔14〕，并且正在迅速成为全世界最常见的肝病〔15〕。老年人因为存在肥胖、代谢速率慢、活动少、血脂水平升高等特点，成为NAFLD的高发人群。中国老年人口每年以3.3%的速度增长〔16〕。

silymarin作为几乎无毒无害的天然药物，具有较强的肝脏保护作用，通常被用作治疗代谢性肝损伤、肝纤维化等疾病〔17〕。NAFLD有发展为肝硬化、肝癌的风险，NAFLD患者存在肝细胞的增生，而细胞过度增生是导致癌症的主要原因。JAK2/STAT3信号通路对于细胞增殖发挥至关重要的作用〔18,19〕，阻断JAK2和STAT3磷酸化可减轻肝细胞脂肪变性〔20〕。本研究结果说明silymarin可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路的激活抑制老年NAFLD大鼠肝细胞的过度增殖，从而达到对NAFLD患者的肝脏保护作用。

综上，silymarin能够抑制NAFLD大鼠肝细胞的增殖，从而缓解肝脏损伤。其机制可能是通过抑制JAK2/STAT3信号通路的激活。