白藜芦醇调控miR-25对高糖诱导成骨细胞增殖和凋亡的作用机制

刘军 任昆明 王志强 朱温帅 孙学成

(潍坊市人民医院创伤骨科，山东 潍坊 261021)

糖尿病性骨质疏松是糖尿病慢性并发症之一，随着糖尿病进程进展表现为骨量减少、骨骼微结构破坏、骨骼脆性增加，易出现骨折。白藜芦醇除具有抗肿瘤、清除自由基、抗感染、心脏和血管保护等多种有益作用，白藜芦醇还具有较强的骨保护作用〔1,2〕。然而，白藜芦醇在糖尿病性骨质疏松中的作用机制并未阐明。研究显示在成骨细胞分化过程中miR-25表达上调，miR-25过表达显著提高细胞活力和迁移能力〔3〕。大黄素通过上调miR-25抑制低氧诱导的PC-12细胞损伤〔4〕。高糖刺激可引起成骨细胞增殖分化能力减弱和凋亡增加，其诱导的成骨细胞是研究糖尿病性骨质疏松的常用细胞模型〔5,6〕。本研究通过观察白藜芦醇对高糖条件下成骨细胞MC3T3-E1增殖、凋亡及miR-25表达的影响，探索其保护作用机制。

1 材料与方法

1.1实验材料 小鼠MC3T3-E1细胞(美国ATCC)；α-MEM低糖型培养基、胎牛血清、青链霉素溶液(美国Gibco公司)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)细胞增殖分析检测试剂盒(武汉艾美捷科技有限公司)；膜联蛋白V异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI，北京索莱宝生物科技有限公司)；TRIzol试剂、放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液、LipofectamineTM2000(美国Invitrogen公司)；兔抗细胞周期素(cyclin)D1抗体、兔抗活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved-caspase)-3抗体、兔源磷酸化NF-κB抑制蛋白(p-IκBα)抗体、兔源p-p65抗体、兔抗β-actin及山羊抗兔IgG(美国Abcam公司)。

1.2细胞培养和模型构建 成骨细胞MC3T3-E1采用α-MEM低糖型培养基(含10%胎牛血清和1%的青链霉素双抗)进行培养，常规换液传代，取对数期细胞进行实验。采用葡萄糖浓度为5.5、25.0 mmol/L的α-MEM培养液培养细胞7 d，依次计为正常对照(NC)组和高糖(HG)组。

1.3MTT法检测细胞活力 将MC3T3-E1细胞按照5×103个/孔接种到96孔板并分为NC组、HG组、HG+20 μmol/L白藜芦醇组(在高糖诱导基础上给予终浓度为20 μmol/L白藜芦醇培养48 h)、HG+40 μmol/L白藜芦醇组(在高糖诱导基础上给予终浓度为40 μmol/L白藜芦醇培养48 h)、HG+80 μmol/L白藜芦醇组(在高糖诱导基础上给予终浓度为80 μmol/L白藜芦醇培养48 h)，各组细胞进行相应处理后，每孔加入20 μl的MTT，培养箱继续孵育4 h，弃去上清液，加入150 μl的二甲基亚砜(DMSO)振荡溶解10 min，酶标仪测定450 nm波长处的吸光度值。确定用药浓度。

1.4流式细胞术检测细胞凋亡 收集NC组、HG组、HG+40 μmol/L白藜芦醇组MC3T3-E1细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次，加入适量的1×结合缓冲液调整细胞浓度为1×105个/ml细胞悬液。取100 μl细胞悬液加入流式管，分别加入5 μl的Annexin V-FITC和PI，避光孵育15 min，补加1×结合缓冲液至500 μl，1 h内上机检测细胞凋亡情况。

1.5RT-qPCR检测miR-25的表达水平 收集NC组、HG组、HG+40 μmol/L白藜芦醇组MC3T3-E1细胞，PBS洗涤细胞2次，按照TRIzol试剂盒说明书提取各组细胞的总RNA，按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA，利用实时定量PCR仪进行扩增。引物序列如下：miR-25上游引物5′-CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA-3′，下游5′-UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6为内源性参照，根据2-ΔΔCt法计算miR-25的表达水平。

1.6Western印迹检测Cleaved-caspase-3的表达水平 收集NC组、HG组、HG+40 μmol/L白藜芦醇组MC3T3-E1细胞，RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，测定蛋白浓度。按照蛋白变性、配胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳、常规转膜、膜的封闭步骤进行。随后采用稀释的Ⅰ抗溶液在室温条件下孵育膜2 h，洗膜后，采用稀释的Ⅱ抗溶液在室温条件下孵育膜1 h，洗膜后，采用化学发光显色剂于暗室内显色。以β-actin为内参，采用ImageJ进行分析，以目标蛋白与内参蛋白灰度值的比值表示目标蛋白的表达水平。

1.7高表达miR-25对MC3T3-E1细胞增殖和凋亡的影响 将MC3T3-E1细胞接种到96孔板并分为NC组、HG组、HG+miR-con组(转染miR-con后进行高糖刺激)、HG+miR-25组(转染miR-25 mimics后进行高糖刺激)。按照上述1.3方法步骤分别检测细胞的存活和凋亡情况及cyclinD1、cleaved-caspase-3和miR-25表达水平。

1.8白藜芦醇调控miR-25对高糖诱导的成骨细胞增殖和凋亡的影响 为证实白藜芦醇是通过上调miR-25进而影响高糖诱导的成骨细胞增殖和凋亡，将MC3T3-E1细胞分为白藜芦醇+HG+anti-miR-con组(转染anti-miR-con至MC3T3-E1细胞，随后进行高糖刺激和40 μmol/L白藜芦醇干预)、白藜芦醇+HG+anti-miR-25组(转染anti-miR-25至MC3T3-E1细胞，随后进行高糖刺激和40 μmol/L白藜芦醇干预)。按照上述1.3方法步骤分别检测MC3T3-E1细胞存活、凋亡及cyclinD1、cleaved-caspase-3表达情况。细胞转染严格按照LipofectamineTM2000使用说明进行转染。

1.9白藜芦醇对高糖诱导的成骨细胞NF-κB信号通路的影响 收集HG组、白藜芦醇+HG组、白藜芦醇+HG+anti-miR-con组、白藜芦醇+HG+anti-miR-25组MC3T3-E1细胞，按照上述Western印迹检测步骤测定核因子(NF)-κB信号通路蛋白p-p65和(p-IκBα)的表达水平。本研究所有实验设置3个复孔或平行实验，重复3次，取平均值。

1.10统计学分析 采用SPSS18.0软件进行t检验，方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1不同浓度白藜芦醇对高糖诱导的成骨细胞增殖的影响 与NC组〔(100.11±10.05)%〕比较，HG组MC3T3-E1细胞的存活率〔(36.56±3.66)%〕显著降低；与HG组比较，HG+白藜芦醇组MC3T3-E1细胞的存活率显著升高〔20 μmol/L白藜芦醇(52.35±5.25)%、40 μmol/L白藜芦醇(88.36±8.84)%、80 μmol/L白藜芦醇(90.21±9.03)%，P<0.05〕。随着白藜芦醇浓度的逐渐增加，细胞存活率显著升高，呈一定剂量依赖关系。选取40 μmol/L的白藜芦醇浓度进行后续研究。

2.240 μmol/L白藜芦醇对高糖诱导的成骨细胞凋亡的影响 与NC组比较，HG组MC3T3-E1细胞Cleaved-caspase-3蛋白表达水平、细胞凋亡率均显著增加(均P<0.05)；与HG组比较，HG+40 μmol/L白藜芦醇组MC3T3-E1细胞Cleaved-caspase-3蛋白表达水平、细胞凋亡率均显著降低(均P<0.05)。见图1、图2、表1。

图1 流式细胞仪检测细胞凋亡

1～3：NC组，HG组，HG+40 μmol/L白藜芦醇组图2 流式细胞仪检测细胞凋亡

表1 40 μmol/L白藜芦醇对高糖诱导的成骨细胞凋亡的影响

2.340 μmol/L白芦藜醇对miR-25表达水平的影响 与NC组(1.00±0.11)比较，HG组MC3T3-E1细胞miR-25表达水平(0.36±0.04)显著降低；与HG组比较，HG+40 μmol/L白藜芦醇组MC3T3-E1细胞miR-25的表达水平显著升高(0.89±0.09,P<0.05)。

2.4高表达miR-25对MC3T3-E1细胞增殖和凋亡的影响 与NC组比较，HG组MC3T3-E1细胞miR-25、CyclinD1蛋白表达、细胞存活率显著降低，Cleaved-caspase-3蛋白表达、细胞凋亡率显著升高(均P<0.05)；与HG+miR-con组比较，HG+miR-25组MC3T3-E1细胞miR-25、CyclinD1蛋白表达、细胞存活率显著升高，Cleaved-caspase-3蛋白表达、细胞凋亡率显著降低(均P<0.05)。见图3和表2。

1～4:NC组,HG组,HG+miR-con组,HG+miR-25组图3 Western印迹检测CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表达

表2 高表达miR-25对MC3T3-E1细胞增殖和凋亡的影响

2.5低表达miR-25可以逆转白藜芦醇对高糖诱导的成骨细胞增殖和凋亡的影响 与白藜芦醇+HG+anti-miR-con组比较，白藜芦醇+HG+anti-miR-25组MC3T3-E1细胞miR-25、CyclinD1蛋白表达、细胞存活率显著降低，Cleaved-caspase-3蛋白表达、细胞凋亡率显著升高(均P<0.001)。见表3、图4。

表3 低表达miR-25可以逆转白藜芦醇对高糖诱导的成骨细胞增殖和凋亡的影响

1，2：白藜芦醇+HG+anti-miR-con组,白藜芦醇+HG+anti-miR-25组图4 Western印迹检测CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表达

2.6NF-κB信号通路的蛋白表达 与HG组比较，白藜芦醇+HG组p-p65、p-IκBα蛋白表达水平显著降低(均P<0.05)；与白藜芦醇+HG+anti-miR-con组比较，白藜芦醇+HG+anti-miR-25组p-p65、p-IκBα蛋白表达水平显著升高(均P<0.05)。见图5和表4。

1～4：HG组,白藜芦醇+HG组，白藜芦醇+HG+anti-miR-con组,白藜芦醇+HG+anti-miR-25组图5 Western印迹检测p-p65、p-IκBα蛋白的表达

表4 Western印迹检测NF-κB信号通路蛋白的表达

3 讨 论

成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，在整个骨形成过程中，成骨细胞的增殖减弱和凋亡增加是骨量减少的重要原因之一。白藜芦醇具有较强的骨保护作用。Durbin等〔7〕研究表明白藜芦醇的摄入可防止大鼠后肢的骨质流失；蔡德等〔8〕研究发现白藜芦醇还可促进人骨髓基质细胞的增殖和成骨分化；白藜芦醇还可提高成骨细胞活力，改善糖尿病患者钛合金内植物的骨整合效果〔9〕。本研究表明白藜芦醇可提高成骨细胞活力，对高糖诱导的成骨细胞凋亡具有显著的抑制作用。

miR-25是一种与骨修复密切相关的微小RNA，Lang等〔10〕研究显示高表达miR-25可促进骨折端成骨细胞分化，促进骨痂形成及骨折愈合，增加骨最大负荷、断裂能量和刚度。Li等〔3〕研究发现miR-25通过上调Rac1表达激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路促进成骨细胞的分化和迁移。此外，杨丽等〔11〕研究指出miR-25通过靶向TWIST1调控骨细胞的矿化。本研究显示高糖刺激后MC3T3-E1细胞miR-25的表达水平显著降低，而一定浓度的白藜芦醇干预可提高高糖刺激下miR-25表达水平。进一步研究显示过表达miR-25可提高MC3T3-E1细胞促增殖蛋白CyclinD1的表达水平，降低促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3的表达，促进细胞存活，抑制细胞凋亡，减轻高糖刺激对MC3T3-E1细胞的增殖抑制和凋亡促进作用，与白藜芦醇对高糖诱导的MC3T3-E1细胞保护作用一致。此外，低表达miR-25可逆转白藜芦醇对高糖诱导的MC3T3-E1细胞增殖和凋亡的影响。以上研究表明白藜芦醇通过上调miR-25表达对高糖诱导的成骨细胞发挥保护作用。

NF-κB作为一种重要的细胞内信号通路，在骨重塑过程中发挥重要作用〔12〕。鹿茸多肽通过抑制NF-κB信号通路增强成骨细胞分化抑制破骨细胞形成对类风湿关节炎和骨质疏松等骨溶解性疾病具有潜在的治疗作用〔13〕。薯蓣皂苷通过抑制NF-κB信号通路对成骨细胞的增殖和分化具有一定的促进作用〔14〕。此外，白藜芦醇通过下调NF-κB信号通路对骨关节炎软骨病变具有保护作用〔15〕。本研究提示白藜芦醇通过调控miR-25抑制NF-κB信号通路对高糖诱导的成骨细胞凋亡具有保护作用。