千里光总黄酮上调miR-520e对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

张春瑞 卞艳丽 张体鹏 薛飞

(郑州澍青医学高等专科学校临床医学系，河南 郑州 450000)

肝癌是消化道常见恶性肿瘤，预后较差，中医药疗法是当前治疗肝癌的重要辅助手段，且中医治疗具有多靶点、整体治疗特点，具有减轻化疗不良反应、预防肿瘤复发、延缓生命等作用，研究中医治疗的分子机制，以期为临床中医治疗提供理论依据〔1，2〕。千里光是菊科千里光属的多年生草本植物，常用草药，黄酮是其主要化学成分，其具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等作用〔3，4〕。研究报道千里光提取物对肝癌细胞株Be17402、SMMC7721，卵巢癌细胞HO8910，胃癌细胞SGC7091具有体外增殖抑制的作用〔5〕。千里光总碱和千里光碱可以抑制体外培养的小鼠黑色素瘤细胞增殖〔6〕。千里光总黄酮对肝癌细胞株SMMC7721、胃癌细胞株SGC7091和乳腺癌细胞株MCF7具有明显抑制作用〔7〕。但千里光总黄酮对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响及其机制尚不清楚。microRNA(miR)是一类高度保守的，内源性非蛋白编码的小分子RNA，其在细胞周期调控，程序性死亡，细胞分化及代谢等活动中发挥重要作用，可作为中草药防治肝癌的新靶点〔8〕。研究报道miR-520e是一个新的抑癌miRNA，其可抑制肝癌的增殖〔9〕。miR-520e调节乳腺癌细胞的增殖，凋亡和迁移〔10〕。因此，本实验旨在研究千里光总黄酮对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响及其机制是否与miR-520e有关。

1 材料与方法

1.1材料 细胞Huh-7购自美国ATCC；千里光购自江苏省徐州市世元药业，经鉴定为菊科千里光属植物千里光；胎牛血清、RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡检测试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；Transwell小室、基质胶购于美国BD公司；放射免疫沉淀试验(RIPA)蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒、实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司。

1.2千里光总黄酮的制备 千里光药材烘干至恒重后粉碎，取5 g粗粉，加入60%乙醇200 ml，超声波辅助提取3次，每次1 h，过滤后合并滤液，减压旋转蒸发，然后定容至100 ml。取所得样品溶液1 ml于10 ml的容量瓶，加入5%亚硝酸钠溶液0.4 ml，摇匀，静置6 min；加入10%硝酸铝溶液0.4 ml，摇匀，静置6 min；再加入4%氢氧化钠溶液4 ml，用乙醇定容至刻度，摇匀，静置15 min；在510 nm处测定吸光度值。

1.3细胞培养与分组 细胞Huh-7用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液在37℃、5%CO2条件下培养，取对数生长期Huh-7细胞，用浓度分别为12.5、25.0、50.0 μg/ml的千里光总黄酮处理Huh-7细胞，作为低、中、高剂量组；正常培养的细胞作为对照组。将miR-NC、miR-520e转染至Huh-7细胞中，记为miR-NC组、miR-520e组；将miR-NC、miR-520e转染至Huh-7细胞中再用浓度为50.0 μg/ml的千里光总黄酮处理，记为高剂量+miR-NC组、高剂量+miR-520e组。

1.4细胞周期检测 各组细胞培养48 h后收集细胞，并制备单细胞悬液，加入3 ml预冷的70%乙醇固定，用缓冲液洗涤后加入核糖核酸酶(RNase)A于37℃水浴30 min，加入400 μl PI，4℃避光30 min，上机检测激发波长488 nm处红色荧光，重复3次。用流式细胞仪和DNA细胞周期分析软件对细胞周期进行检测分析。

1.5细胞凋亡检测 各组细胞培养48 h后用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗2次，与500 μl结合缓冲液混匀。先加入10 μl Annexin V-FITC，再加入5 μl PI，混匀后避光孵育10 min。用流式细胞仪检测细胞凋亡率。每组设3个复孔，重复3次。

1.6Transwell检测细胞迁移和侵袭 收集各组细胞，无血清培养后，取200 μl接种于Transwell小室上层，培养24 h后，吸去培养液后用棉签轻轻擦去上层细胞，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定30 min，再用0.1%结晶紫染色10 min，显镜下拍照并计数发生迁移的细胞数量。细胞侵袭实验在Transwell小室上层加入50 μl基质胶，凝固后接种细胞，之后同细胞迁移操作。

1.7Western印迹检测Ki67、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)3、N-钙黏附蛋白(N-cadherin)、E-钙黏附蛋白(E-cadherin)蛋白表达 提取各组细胞总蛋白，用BCA试剂盒进行蛋白定量。各组蛋白上样量60 μg，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后，经电转将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)上。用5%脱脂牛奶室温封闭90 min，分别加入相应的一抗(1∶800)，4℃孵育过夜，PBS洗涤3次，每次5 min；再加入二抗(1∶1 500)室温孵育2 h，PBS洗涤3次，每次10 min，后在暗室中曝光显影，定影，将胶片用Quantity One凝胶分析软件处理，测定各组蛋白条带的灰度值，以目的条带和GAPDH条带的比值作为蛋白表达水平。

1.8qRT-PCR检测miR-520e表达水平 各组细胞培养48 h后提取细胞总RNA，将RNA反转录成cDNA，进行PCR扩增，每个样品重复3次，循环条件为95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40个循环；60℃延长5 min。相对表达量采用2-△△Ct法计算。miR-520e以U6为内参，miR-520e上游引物序列：5′-AAAGTGCTTCCTTTTTGAGGG-3′，下游引物序列：5′-GGTGCTTCCTTTTTGAGGG-3′；U6上游引物序列：5′-TCCGATCGTGAAGCCTTC-3′，下游引物序列：5′-GTGCAGGGTCCGACGT-3′。

1.9荧光素酶报告实验检测miR-520e对CDK2的靶向调控 TargetScan数据库显示miR-520e与CDK2存在结合位点。构建CDK2野生型(WT)和突变型(MUT)荧光素酶表达载体WT-CDK2和MUT-CDK2，用LipofectamineTM2000将WT-CDK2和MUT-CDK2分别与miR-NC和miR-520e共转染至细胞Huh-7中。按照说明书检测荧光素酶活性。

1.10统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1千里光总黄酮对Huh-7增殖、凋亡的影响 与对照组相比，中、高剂量组G0～G1期细胞所占比例显著升高，S期细胞所占比例显著降低(P<0.05)，G2～M期细胞所占比例无显著差异(P>0.05)；凋亡率显著升高，且呈剂量依赖性(P<0.05)。见图1，表1。

2.2千里光总黄酮对Huh-7迁移、侵袭的影响 与对照组相比，中、高剂量组迁移、侵袭细胞数显著降低，且呈剂量依赖性(P<0.05)。见表1、图2。

图1 千里光总黄酮对Huh-7凋亡率的影响

表1 千里光总黄酮对Huh-7增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响

2.3千里光总黄酮对Huh-7中miR-520e及Ki67、Caspase3、N-cadherin、E-cadherin表达的影响 与对照组相比，中、高剂量组miR-520e表达水平显著升高，Ki67、N-cadherin表达水平显著降低，Caspase3、E-cadherin表达水平显著升高，且呈剂量依赖性(P<0.05)。见表2,图3。

图2 千里光总黄酮对Huh-7迁移、侵袭细胞数的影响(结晶紫染色，×200)

表2 各组miR-520e及Ki67、Caspase3、N-cadherin、E-cadherin蛋白的表达

2.4miR-520e对千里光总黄酮作用的Huh-7增殖、凋亡的影响 与对照组和miR-NC组相比，miR-520e组G0-G1期细胞所占比例显著升高，S期细胞所占比例显著降低(P<0.05)，G2-M期细胞所占比例无显著差异(P>0.05)，凋亡率显著升高(P<0.05)；与miR-520e组和高剂量+miR-NC组相比，高剂量+miR-520e组G0-G1期细胞所占比例显著升高，S期细胞所占比例显著降低(P<0.05)，G2-M期细胞所占比例无显著差异(P>0.05)，凋亡率显著升高(P<0.05)。见图4，表3。

图4 miR-520e对千里光总黄酮作用的Huh-7凋亡率的影响

表3 miR-520e对千里光总黄酮作用的Huh-7增殖、凋亡的影响

2.5miR-520e对千里光总黄酮作用的Huh-7迁移、侵袭的影响 与对照组和miR-NC组相比，miR-520e组迁移、侵袭细胞数显著降低(P<0.05)；与miR-520e组和高剂量+miR-NC组相比，高剂量+miR-520e组迁移、侵袭细胞数显著降低(P<0.05)。见图5,表4。

图5 miR-520e对千里光总黄酮作用的Huh-7迁移、侵袭细胞数的影响(结晶紫染色，×200)

表4 miR-520e对千里光总黄酮作用的Huh-7迁移、侵袭的影响及各组Ki67、Caspase3、N-cadherin、E-cadherin蛋白的表达

2.6miR-520e对千里光总黄酮作用的Huh-7中Ki67、Caspase3、N-cadherin、E-cadherin表达的影响 与对照组和miR-NC组相比，miR-520e组Ki67、N-cadherin表达水平显著降低，Caspase3、E-cadherin达水平显著升高(P<0.05)；与miR-520e组和高剂量+miR-NC组相比，高剂量+miR-520e组Ki67、N-cadherin表达水平显著降低，Caspase3、E-cadherin达水平显著升高(P<0.05)。见表4，图6。

1～5：对照组，miR-NC组，miR-520e组，高剂量+miR-NC组，高剂量+miR-520e组图6 各组Ki67、Caspase3、N-cadherin、E-cadherin蛋白的表达

2.7miR-520e靶向CDK2 TargetScan数据库预测显示miR-520e与CDK2存在结合位点，见图7。荧光素酶报告实验显示，与miR-NC组相比，miR-520e组中转染WT-CDK2的细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；而转染MUT-CDK2的细胞荧光素酶活性无显著差异(P>0.05)。见表5。

图7 CDK2的3′UTR含有miR-520e的互补序列

表5 双荧光素酶报告实验

3 讨 论

黄酮类化合物是一类存在于多种植物中的多酚化合物，其具有许多潜在的药用价值，研究表明天然黄酮类化合物可抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，具有抗肿瘤作用机制〔11〕。研究报道白凤菜总黄酮可抑制肝癌HepG2细胞增殖和诱导细胞凋亡〔12〕。藤茶总黄酮通过激活细胞凋亡磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K或AKT)/p53通路进肝癌细胞凋亡，发挥抗肝癌作用〔13〕。木蝴蝶总黄酮可体外抑制肝癌细胞增殖和迁移〔14〕。已有研究报道千里光总黄酮具有抗肿瘤作用，本研究结果表明中、高剂量的千里光总黄酮可抑制肝癌细胞增殖、迁移、侵袭，促进细胞凋亡。

研究报道miR-520e通过直接靶向Zbtb7a可调节非小细胞肺癌细胞的生长，侵袭和迁移〔15〕。miR-520e过表达通过靶向星形胶质细胞升高基因(AEG)-1显著降低了结直肠癌细胞的增殖，集落形成和侵袭〔16〕。miR-520e通过靶向成纤维细胞生长因子(FGF)19下调Wnt/β-catenin信号传导，从而抑制神经胶质瘤细胞的增殖和侵袭〔17〕。表明miR-520e具有抗癌作用。且已有研究表明miR-520e在肝癌中起抑癌作用〔9〕。本研究结果表明千里光总黄酮可能通过上调miR-520e的表达对肝癌起抑癌作用。

周期素依赖性激酶(CDK)2是细胞周期依赖性激酶家族成员之一，驱动细胞进入细胞周期的S期和M期；其抑制剂可用于癌症治疗〔18〕。研究报道CDK2在原发性肝癌组织中的表达明显增加，其高表达与患者生存率低有关〔19〕，表明CDK2参与肝癌的进展过程，本研究表明miR-520e可通过靶向调控CDK2影响肝癌进展。

综上，千里光总黄酮通过调控miR-520e/CDK2抑制肝癌细胞增殖、迁移、侵袭，促进细胞凋亡。