RhoA/ROCK信号通路在缺氧/复氧诱导心肌H9C2细胞损伤中调控机制

林显文 乔国艳

(成飞医院 1干部保健科，四川 成都 610031；2神经内科)

缺氧性心脏病是由冠状动脉硬化所致血管管腔狭窄阻塞，或冠状动脉功能改变引起心脏正常供血功能受阻，进而发生心肌缺血缺氧导致心肌细胞损伤〔1〕。作为心脏生理功能的基础单元，心肌细胞处于损伤状态时，心肌细胞的基础代谢受到影响，心脏物质及能量交换均处于不正常状态，甚至基本的心脏形态也会随之改变，诱发恶性心脏事件出现〔2〕。缺血再灌注损伤是阻碍缺氧性心脏病患者在再灌注治疗中获益的主要问题，研究发现心肌缺血再灌注会提高心肌细胞凋亡的比例〔3〕，因此明确心肌细胞在缺血再灌注中的损伤及凋亡机制一直是心血管疾病研究的热点。心肌细胞损伤和凋亡，受许多信号通路和调控因子的影响，是体内的一种复杂的生物反应过程〔4〕。研究发现Ras同源基因家族蛋白(Rho)A/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)在心血管疾病中表现出来的对心肌细胞的保护作用引起关注〔5〕。研究表明通过抑制RhoA/ROCK能够促进心肌梗死后充质肝细胞的归巢，减轻心肌梗死的症状〔6〕。RhoA/ROCK已成为心血管疾病分子靶向治疗的研究新方向。但是RhoA/ROCK信号通路在心肌缺血再灌注损伤中的作用鲜有报道。本研究通过体外构建心肌细胞缺氧/复氧模型，探讨RhoA/ROCK在缺血再灌注的心肌细胞损伤与凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1细胞及主要试剂和仪器 H9C2细胞(上海中科院细胞库)；RhoA-siRNA重组腺病毒载体及空载质粒Ad5-EGFP购自上海吉玛生物有限公司；DMEM培养基(TOYOBO)；Trizol 试剂盒(TaKaRa)；Hoechst 33258 染色试剂、DCFH-DA 染液、Rh123染色剂(美国Abcamn公司)；B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、RhoA、SDF-1α、鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体(美国Jackson公司)；Transwell小室(美国BD公司)； Western印迹试剂盒(美国Sigma公司)；全蛋白抽提试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)含量试剂盒(德国QIAGEN公司)；Lipofectamine3000转染试剂(美国vector公司)；磷酸盐缓冲液(PBS，美国Amresco公司)；苏净Airtech超净工作台(北京六一仪器厂)；SANYO MCO-15AC细胞培养箱(美国强生公司)；Nikon Ti-U/Ti-s倒置荧光显微镜(日本三菱公司)；5810R 型高速离心机(日本岛津公司)；微量移液枪(美国Promega公司)；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，美国Corning公司)；E-Gel Imager凝胶成像仪(美国Beckma公司)。

1.2方法

1.2.1心肌缺氧复氧损伤模型的建立及分组处理 细胞分为正常组、模型组、对照组(转染空载质粒Ad5-EGFP)、RhoA-siRNA组(转染RhoA-siRNA)。将H9C2细胞接种于含有灭活的10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于生化培养箱中培养，条件37℃，5%CO2，当贴壁细胞生长密度达85%时，25%胰蛋白酶消化传代。取对数生长期H9C2细胞进行转染，采用Lipofectamine3000通过脂质体介导法，将浓度均为200 nmol/L的空载质粒Ad5-EGFP和RhoA-siRNA重组腺病毒载体转染至H9C2细胞，转染操作完成后，37℃，5%CO2常规培养细胞48 h后进行后续实验。

除正常组外，模型组、对照组、RhoA-siRNA组细胞构建心肌缺氧复氧损伤模型，方法如下： 在37℃、5%CO2、95%空气的培养箱中培养H9C2 细胞，当细胞生长密度超过60%以后，更换培养基，添加等量不含血清的DMEM 培养基，将细胞放在37℃、5%CO2、95%N2的缺氧培养箱中封闭培养12 h。取出培养板，用移液枪把原来的培养液吸除后，再次更换培养基，添加相同体积的10% 胎牛血清的DMEM 培养基，将细胞放在37℃、5%CO2、95%空气的培养箱中继续培养4 h，即为缺氧复氧心肌细胞模型。正常组H9C2细胞始终常规培养。

1.2.2显微镜下观察细胞H9C2形态学变化 调整细胞浓度至1×104个/ml接种于6孔板中，分组处理同上， 37℃，5%CO2生化培养箱中继续培养24 h后，倒置显微镜下观察各组细胞生长状态及形态变化。

1.2.3各组心肌细胞内活性氧(ROS)水平的检测 调整细胞浓度至3×106个/ml接种于24孔板中，分组处理同上，37℃，5%CO2生化培养箱中继续培养24 h后，弃去培养基，PBS缓冲液冲洗2次，转移至5 ml无菌EP管中，1 000 r/min离心5 min，留取沉淀，添加5 μl的10 μmol/L DCFH-DA 染液，37℃避光孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min。上荧光显微镜观察，并且用Image J1.41软件对绿色荧光强度进行统计分析。

1.2.4各组心肌细胞线粒体膜电位的检测 参照JC-1线粒体膜电位检测试剂盒说明书，依次完成实验步骤，将转染后的细胞培养48 h后，在不同波长下观察细胞显色水平，其中红色荧光：激发波长490 nm，发射波长580 nm；绿色荧光：激发波长490 nm，发射波长520 nm 观察。使用计算机采集荧光图像，Image J软件重叠红绿荧光，将合成荧光的红、绿色荧光光密度比值作为膜电位表达水平值。

1.2.5彗星实验测定各组心肌细胞DNA损伤程度 调整细胞浓度至5×105个/ml接种于6孔板中，分组处理同上，37℃，5%CO2生化培养箱中继续培养24 h后，将各组细胞分别与凝胶以1∶10比例混合后铺片，经制片、细胞裂解、解旋、电泳、中和、脱水等步骤后制成单细胞凝胶标本，标本经SYBR胶体染料染色20 min后，实验操作必须在避光下进行，以避免光线引起的DNA的额外损伤。在荧光显微镜下拍照观察，并采用KOMET8.0图像软件分析图像以指标Olive尾矩来评价DNA的损伤程度。

1.2.6各组心肌细胞凋亡的测定 调整细胞浓度至1×105个/ml接种于24孔板中，分组处理同上，37℃，5%CO2生化培养箱中继续培养24 h后，弃去培养基，PBS 缓冲液冲洗2 次，每次5 min，4%甲醛固定10 min，PBS 冲洗3次，每次5 min，加入5 mg/L Hoechst 33258 染色试剂，室温下封闭孵育30 min，PBS 冲洗2次。在荧光显微镜下观察，荧光显微镜下，正常细胞因为染色质分布均匀，细胞核被染成均匀蓝色，而凋亡细胞由于核质固缩严重、核膜碎裂被染成明亮的蓝色。

1.2.7Western印迹检测各组心肌细胞中Bax、Bcl-2、RhoA、ROCK1、ROCK2的表达 调整细胞浓度，分组处理同上，37℃，5%CO2生化培养箱中继续培养24 h后，按照细胞浓度1×106个/ml加入300 μl的放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r/min，离心10 min，收集上清液，采用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒检测蛋白浓度，将蛋白样品和结合缓冲液混合，进行SDS-PAGE(5%浓缩胶，10%分离胶)，每孔上样量25 μl，电泳结束后，4℃转膜1.5 h，采用5%脱脂奶粉封闭聚偏氟乙烯(PVDF)膜2 h，加入预稀释的一抗，4℃过夜，TBST充分洗膜后加入二抗，37℃孕育2 h，加入ECL显色液，室温避光显色30 min，采用E-Gel Imager自动凝胶成像系统扫描图像，以GAPDH作为内参，分析蛋白水平。

1.3统计学分析 采用SPSS19.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1细胞形态学变化观察 倒置显微镜下观察各组细胞的形态学改变，正常组细胞生长旺盛，形状规整，多呈梭形，排列均一，细胞核形状规则且清晰可辨，核质间隙清楚，细胞内容物均匀透明，细胞膜结构完整，膜表面平滑无褶皱；与正常组细胞相比，模型组、对照组、RhoA-siRNA组细胞生长出现不同程度的缓慢，模型组细胞呈现十分明显凋亡特征，大多数细胞已成圆形，胞体严重皱缩，细胞核固缩明显，部分核膜已经破裂，细胞膜虽然完整，但皱缩严重，胞膜结构变性明显，圆形漂浮细胞数目增多；对照组与模型组细胞相差不大，出现大量凋亡细胞；与模型组和对照组相比，RhoA-siRNA组细胞生长状态良好，圆形漂浮细胞明显减少，细胞核形状趋于规则，核膜基本完整，凋亡现象较轻。见图1。

图1 显微镜观察各组H9C2细胞的形态学变化(×200)

2.2细胞内ROS水平的检测 模型组H9C2细胞绿色荧光强度〔(7.80±0.56)×105U/ml〕明显强于正常组〔(2.10±0.42)×105U/ml，P<0.05〕；RhoA-siRNA组H9C2细胞绿色荧光强度明显弱于模型组(P<0.05)，对照组〔(7.65±0.64)×105U/ml〕与模型组差异不明显(P>0.05)，见图2。

图2 各组心肌细胞内活性氧水平的检测(DCFH-DA染色，×400)

2.3各组心肌细胞线粒体膜电位的检测 模型组H9C2细胞线粒体膜电位〔(80.50±7.78)%〕明显高于正常组〔(6.58±0.42)%，P<0.05〕；RhoA-siRNA组H9C2细胞线粒体膜电位〔(41.50±4.95)%〕明显低于模型组(P<0.05)，对照组〔(78.50±4.19)%〕与模型组差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

图3 各组心肌细胞线粒体膜电位的检测(JC-1染色，×400)

2.4彗星实验测定各组心肌细胞DNA损伤程度 模型组H9C2细胞的Olive尾矩〔(77.82±7.07)μm〕明显长于正常组〔(15.56±2.24)μm，P<0.05〕，RhoA-siRNA组H9C2细胞的心肌细胞Olive尾矩〔(47.54±4.78)μm〕明显短于模型组(P<0.05)，对照组〔(74.68±8.36)μm〕与模型组差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

2.5各组心肌细胞凋亡的测定 模型组细胞凋亡率、Bax的表达水平明显高于正常组(P<0.05)，Bcl-2的表达水平明显低于正常组(P<0.05)；RhoA-siRNA组细胞凋亡率、Bax的表达水平明显低于模型组(P<0.05)，Bcl-2的表达水平明显高于模型组(P<0.05)；对照组与模型组差异无统计学意义(P>0.05)，见图5、6，表1。

图5 各组心肌细胞凋亡的测定(Hoechst33258染色，×200)

图6 Western印迹检测与凋亡相关的蛋白Bax、Bcl-2的表达

2.6Western印迹检测各组心肌细胞中RhoA、ROCK1、ROCK2的表达 模型组心肌细胞RhoA、ROCK1、ROCK2的表达水平明显高于正常组(P<0.05)，RhoA-siRNA组RhoA、ROCK1、ROCK2的表达水平明显低于模型组(P<0.05)，对照组与模型组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1、图7。

表1 各组心肌细胞凋亡率、RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白及凋亡相关蛋白表达的比较

图7 Western印迹检测RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白的表达

3 讨 论

心肌细胞凋亡失常是心血管疾病中最重要的病理学改变，尤其是心脏再灌注治疗之后的心肌细胞凋亡已成为手术成败的关键因素〔7〕，国内外的众多学者就心肌细胞的异常凋亡开展大量的研究。已有研究表明阻止心肌细胞在遭受刺激时引发的损伤能够明显的抑制心肌细胞的凋亡〔8〕。已有研究证实机体内多种信号分子调控或者参与心肌细胞的损伤及凋亡〔9〕。心脏是能量消耗较高的器官，线粒体是细胞进行能量代谢的场所。研究表明心脏能量代谢失常是心肌细胞凋亡的始动事件，线粒体膜电位的下降是心肌细胞早期凋亡的标志性事件，抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax的比值降低是启动线粒体凋亡途径的开关〔10〕。研究报道称缺血再灌注后心肌细胞Bcl-2的表达减少， Bax的表达增加，心肌细胞凋亡率升高〔11〕。有学者研究证实在对心肌缺血再灌注大鼠进行抗细胞凋亡干预后，明显改善了大鼠的心功能及减小其心脏发生微梗死的面积〔12〕。另有研究报道改善缺血再灌注大鼠的线粒体功能，调控Bcl-2与Bax的表达比值，提高其线粒体膜电位，恢复心肌细胞线粒体的能量代谢过程，能明显降低心肌细胞的凋亡率〔13〕。此外，氧化应激在细胞的生长过程中发挥重要作用，而由自由基介导的细胞过氧化损伤可严重损伤细胞DNA，线粒体是含有大量抗氧化酶的细胞器，可及时清除活性氧自由基，一旦受到损伤，不仅造成功能降低，还会使细胞因过高的氧化应激水平而发生凋亡。本研究结果说明在缺氧/复氧过程中，心肌细胞会因线粒体损伤而提高细胞氧化应激水平从而发生凋亡。

RhoA/ROCK通路是机体内重要的信号通路，Rho是小分子G蛋白的成员之一，常作为信号转导的分子开关，直接参与调控细胞形态维持、细胞黏附与迁移、平滑肌收缩等多种细胞生物效应〔14〕。ROCK主要包括ROCK1和ROCK2两种亚型，是RhoA下游最重要的效应器，具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，在细胞增殖与凋亡，黏附与分裂中发挥重要作用〔15〕。Yasue等〔16〕临床研究表明RhoA/ROCK通路与冠状动脉的病变密切相关。实验数据证明抑制RhoA/Rho通路后，ROCK的转录功能降低，能够明显抑制心肌细胞的凋亡，改善慢性心力衰竭大鼠的左心室重构〔17〕。Cui等〔18〕研究证实对缺血再灌注大鼠进行法舒地尔(RhoA/ROCK通路抑制剂)治疗后，其线粒体功能明显恢复，心脏的能量代谢和心功能明显改善。另有研究发现，RhoA/ROCK通路可通过促进线粒体损伤而提高细胞的氧化应激水平〔19〕。本研究结果表明抑制RhoA/ROCK通路，能明显改善缺氧/复氧心肌细胞的损伤。