温肾潜阳汤调控SIRT6表达治疗高血压肾损害的机制

王刚 艾望 周磊 刘涛 王珍 吕奇 金劲松

(1武汉市中医医院肾内科，湖北 武汉 430051；2湖北省中医院肾内科)

高血压为危害人类健康的主要心血管疾病之一，病情进展缓慢，可诱导多器官功能损伤，肾脏是高血压损伤的主要靶器官之一，高血压可致慢性进行性肾病，最终导致肾小球硬化及肾小管间质纤维化，进展为终末期肾衰竭〔1〕。研究表明，高血压肾损伤早期病情具有一定隐匿性，随着病情加重，肾功能损伤逐渐加重，最终导致肾衰竭，增加了临床治疗的难度且治疗效果差，远期生存率低〔2〕。中医理论认为，肾气不足是高血压病理的重要因素，肾阳不足、温煦作用失常是其内在病理表现，通过补肾填精、滋补肝肾、温补肾阳、活血化瘀祛痰诸法调理肾脏功能，对于改善高血压的治疗现状具有重要意义〔3〕。研究表明，高血压肾损伤与炎性反应、氧化应激有关〔4，5〕。SIRT6作为Sirtuin蛋白家族成员，也与肾损伤有关〔6〕。本文拟分析温肾潜阳汤对高血压肾损害的治疗效果及治疗机制。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物：于北京维通利华实验动物技术有限公司购买SPF级自发性高血压大鼠(SHR)24只和WKY雄性大鼠8只，16周龄雄性，动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0006。在武汉市中医医院动物实验室(SPF级)适应性饲养1 w，室温(22±2)℃、相对湿度(55±5)%、光照周期12∶12 h。实验期间保证所有大鼠饮水、饮食充足，定时更换敷料。药物与主要试剂：温肾潜阳汤由制附片6 g，肉桂6 g，炙甘草10 g，茯苓15 g，补骨脂30 g，生龙骨20 g，生牡蛎20 g，菟丝子15 g，芡实15 g，仙灵脾15 g组成，购自武汉市中医医院中药房。生药浸水1 h，大火煎沸30 min，小火煎30 min。过滤后的药渣再次加水煮沸，重复2次，合并煎煮液，在水浴中浓缩，置4℃冰箱，按实验需要浓缩备用；缬沙坦胶囊(代文)80 mg/粒，购自武汉市中医医院西药房；转化生长因子(TGF)-β1试剂盒(ADL美国，批号：200911051558)；血尿素氮(BUN)试剂盒(建成生物工程研究所，南京)；血管紧张素(Ang)Ⅱ、尿微量白蛋白(m-ALB)试剂盒(安诺瑞康生物技术有限公司，天津)；大鼠尾动脉血压测定仪(Kent Scientific，美国)；PCR扩增仪(Bio-Rad，美国)；BP-6型动物无创血压测试仪(泰盟科技有限公司，成都)；Centrifuge5417R型离心机(赛多利斯仪器系统有限公司，北京)；Leica2135型石蜡切片机；BM-11型病理组织包埋机(电子科学研究所，安徽)；JEM1200-EX透射电子显微镜(JEOL公司，日本)。

1.2动物分组及模型制备 适应性喂养1 w后收集SHR大鼠24 h尿液检测m-ALB含量，以24 h尿液中m-ALB为20～200 mg/L为高血压肾损害模型制备成功标准。将SHR大鼠随机分为模型组、缬沙坦组、温肾潜阳汤组，并以同龄WKY大鼠为对照组，每组8只。对照组和模型组每日灌胃给予2 ml生理盐水；缬沙坦组给予缬沙坦按8 mg/kg灌胃；温肾潜阳汤组给予16 g/kg温肾潜阳汤煎剂灌胃。每组每日灌胃给药一次，连续给药8 w〔5〕。

1.3指标检测 末次给药结束后，称量各组体重。然后使用尾动脉血压测量仪在大鼠尾动脉充分扩张后检测各组尾动脉血压并进行记录〔7〕。

通过试剂盒检测一般指标，包括血肌酐(Scr)、BUN、24 h m-ALB、24 h尿蛋白(U-TP)。以代谢笼收集各组大鼠给药结束后24 h尿液，混匀后收集约 10 ml中层尿液，离心，全自动生化仪检测24 h U-TP含量，使用试剂盒测定24 h m-ALB水平。给药结束后，大鼠腹腔注射10% 水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，血样4 000 r/min 离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明书Scr和BUN水平〔8〕。

1.4苏木素-伊红(HE)染色检测各组肾组织病理形态 切取大鼠肾脏组织，使用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片(厚度为4 μm)，进行HE 染色，光镜下观察肾脏病理形态学改变〔9〕。

1.5透射电镜观察各组肾脏超微结构 取各组大鼠肾组织，生理盐水清洗后擦干，切成1 cm3小块，用2.5%戊二醛固定，然后磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次。使用锇酸染色后，树脂包埋，切片(60 nm)，进行复染，使用透射电子显微镜对肾脏标本进行观察拍照〔10〕。

1.6酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组Ang-Ⅱ、TGF-β1、一氧化氮(NO)水平 对小鼠肾组织进行分离后取出上清液，参照小鼠ELISA试剂盒说明书检测血清中Ang-Ⅱ、TGF-β1、NO水平，取适量蛋白样品液，在组织标本中加入50 μl样本分析缓冲液，将其加入相应孔中，并在室温下孵育2 h，洗涤板5次，加入100 μl抗体工作液，在室温下孵育1 h，加入酶结合物100 μl，避光孵育20 min，加入显色剂后，避光孵育20 min，加入50 μl终止液，混匀后使用分光光度计测量450 nm处OD值，设置6个空白孔进行平行对照，根据标准曲线得到各指标浓度〔11〕。

1.7qRT-PCR检测各组肾组织SIRT6、胶原蛋白(Collagen)Ⅰ、纤维连接蛋白(FN)表达水平 在无RNA酶条件下提取肾组织30 mg，使用RNA提取试剂盒分离出总的RNA，然后使用PrimeScriptTMRT试剂盒进行逆转录。qRT-PCR在应用生物系统QuantStudio6RT-PCR系统上进行，使用TBGreen®预处理ExTaqTMⅡ(TaKaRa)。qRT-PCR扩增条件：在95℃下10 min，然后在95℃下40个周期10 s，在60℃下34 s。每个试验重复进行3次。采用2-ΔΔCt法测定靶基因的相对mRNA表达水平〔12〕。

1.8统计学方法 采用SPSS26.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1HE染色检测各组肾组织病理形态 对照组肾组织未见明显增厚、肥大和增生。与对照组相比，模型组肾组织增厚，平滑肌细胞肥大和增生，管壁内胶原增加，管腔狭窄。与模型组相比，温肾潜阳汤组、缬沙坦组肾脏细小动脉病变减轻，见图1。

图1 HE染色检测各组肾组织病理形态(×100)

2.2透射电镜观察各组肾脏超微结构 对照组内皮细胞形态、大小正常，足突排列整齐规则；模型组内皮细胞增大且形态不规则，足突融合、消失，系膜基质增多；温肾潜阳汤组和缬沙坦组内皮细胞有轻微肿胀，形态欠规则，足突有小部分融合但排列较整齐，见图2。

红箭头指示内皮细胞；黄箭头指示足突图2 透射电镜观察各组肾脏超微结构(×3 000)

2.3各组Scr、BUN、m-ALB、U-TP水平比较 模型组Scr、BUN、m-ALB、U-TP水平显著高于对照组(P<0.05)；温肾潜阳汤组、缬沙坦组显著低于模型组(P<0.05)，见表1。

2.4各组体重和血压水平 与对照组相比，模型组体重明显降低，收缩压及舒张压明显升高(P<0.05)；与模型组相比，温肾潜阳汤组、缬沙坦组体重明显升高，收缩压及舒张压明显降低(P<0.05)，见表1。

表1 各组Scr、BUN、m-ALB、U-TP水平比较

2.5各组Ang-Ⅱ、TGF-β1、NO水平比较 与对照组相比，模型组Ang-Ⅱ、TGF-β1水平明显升高，NO水平明显降低(P<0.05)。与模型组相比，温肾潜阳汤组、缬沙坦组Ang-Ⅱ、TGF-β1水平明显降低，NO水平明显升高(P<0.05)，见表2。

表2 各组Ang-Ⅱ、TGF-β1、NO水平比较

2.6qRT-PCR检测各组肾组织SIRT6、CollagenⅠ、FN表达水平 与对照组相比，模型组肾组织SIRT6水平明显降低，CollagenⅠ、FN表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组相比，温肾潜阳汤组、缬沙坦组肾组织SIRT6水平明显升高，CollagenⅠ、FN表达水平明显降低(P<0.05)，见表3。

表3 qRT-PCR检测各组肾组织SIRT6、CollagenⅠ、FN表达水平

3 讨 论

高血压肾病是指原发性高血压引起的良性肾小动脉硬化和恶性小动脉肾硬化，并伴有相应临床表现的一种疾病，是高血压常见的慢性并发症之一，由高血压导致的慢性肾病已成为终末期肾病的第2 位常见病因〔13〕。缬沙坦为AngⅡ受体拮抗剂类药物，可有效拮抗血管紧张素受体，继而发挥降压作用，且临床证实缬沙坦具有长效、安全性和特异性高等特点，在高血压患者病情控制中效果较好〔14,15〕。BUN、SCr 是评估肾功能的关键指标。m-ALB在肾脏出现损害时浓度上升〔16〕。说明温肾潜阳汤可起到缓解肾损伤的作用。AngⅡ可通过与AT1R结合导致血管收缩、水钠潴留，促进醛固酮分泌，最终促使高血压的发生〔17〕。此外，AngⅡ还可减少高血压对肾脏、心脏等慢性损伤，而且与肾脏肥大、细胞增生、细胞外基质合成增加而降解减少等有关，其中TGF-β1起关键作用〔18〕。AngⅡ异常表达可直接刺激TGF-β1活性，直接调节细胞外基质(ECM)成分如各型胶原 Col-Ⅰ、Col-Ⅳ、FN等启动子的活性，从而增加 ECM 合成，导致肾纤维化，参与肾脏炎性反应〔19,20〕。研究发现，高血压的发生发展伴随全身慢性炎症的发生，而炎症因子浸润肾脏后参与氧化应激损伤，进一步加重肾脏炎症〔21〕。NO是主要的舒血管物质。本研究结果说明温肾潜阳汤可起到降低血压，抑制肾组织炎症反应，保护肾组织的作用。

研究发现，SIRT6主要位于细胞质内，对于调控肾脏内稳态具有重要作用，SIRT6基因缺失会导致足细胞功能损伤，包括足细胞裂孔隔膜蛋白及足突消失，同时可加速肾脏肥大和蛋白尿的进展〔22〕。刘敏〔23〕研究也发现SIRT6可能是维持足细胞正常功能和形态的关键分子，主要可通过抗炎症、抗凋亡、抑制足细胞骨架重排及调控足细胞自噬发挥足细胞保护作用。

综上，温肾潜阳汤通过调控SIRT6的表达，能够治疗高血压所导致的肾损害。