三七总皂苷减弱多黏菌素E诱导小鼠肾毒性

樊楚明 茹金 任靖宇 杨晓华 杨金伟 陈庆宁

(云南省第一人民医院 1重症医学科，云南 昆明 650032；2普外二科；3皮肤科)

多黏菌素(PM)是从多粘杆菌培养液中分离出的一种多肽类抗生素，根据化学结构的不同，分为A、B、C、D、E 5种，PME曾被用于治疗革兰阴性菌感染，因为肾毒性被弃用〔1〕。随着多耐药革兰阴性菌(尤其是铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌)的出现，新代抗生素的更新速度缓慢，PME的应用受到临床关注〔2〕。三七总皂苷(PNS) 是从三七中提取的有效生物成分，已有研究报道了其在免疫、心血管、内分泌及中枢神经系统中的药理作用〔3～6〕，PNS可能通过抑制线粒体途径减少肾毒性。动物研究表明，PNS能有效发挥治疗肾小管间质纤维化的作用〔7〕。本研究旨在探讨PNS减弱PME诱导的小鼠肾毒性机制。

1 资料和方法

1.1体内实验

1.1.1动物实验 雌性昆明小鼠购自中国科学院上海药物研究所实验动物中心〔生产许可SCXK：(沪)2019-0001；使用许可号：(沪)2019-0032〕，6～8周龄，体重18～20 g，SPF级。所有小鼠于SPF级动物房适应1 w后方可进行实验。将小鼠随机分为4组，每组6只。对照组：肌肉注射生理盐水(200 μl)；PNS组：肌肉注射PNS(10 mg/kg)；PME组：肌肉注射PME(15 mg/kg)；PNS+PME组：肌肉注射PNS(10 mg/kg)+ PME(15 mg/kg)。所有小鼠每天进行2次肌肉注射，注射时间间隔≥8 h，连续2 w。实验终点时，4%水合氯醛麻醉后心脏采血，处死后收集并保存小鼠双肾进行下一步实验。小鼠血液样本离心(2 000 r/min，5 min)，取上层血清-80℃保存备用。本研究取得医院伦理委员会批准，伦理批号：2018LH095。

1.1.2评估指标 (1)实验期间，每天对小鼠称重并记录，实验终点称量小鼠双肾质量，计算肾系数，肾系数=(肾脏质量/体重)×100%。(2)肾功能相关指标：取小鼠血液上清，采用全自动生化仪测定肾功能指标：血尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)。(3)肾脏组织氧化应激指标：取出小鼠的肾脏组织，研磨器手工研磨，加入冷生理盐水制成匀浆，离心(3 500 r/min，10 min)，取上清液，检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)。(4) 肾脏组织病理学改变取小鼠肾脏组织，经10%甲醛固定，包埋、切片后，苏木素-伊红(HE)染色后在显微镜下观察组织病理学变化。

1.2体外实验

1.2.1细胞培养 小鼠肾小管上皮细胞(TCMK)-1购自美国模式培养物集存库(ATCC)。在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，置于5%CO2、37℃的培养箱中培养12 h后分别加入各组。对照组：不加任何其他物质。PME组：加入不同浓度的PME，根据PME浓度的不同分为不同的亚组，PME25组：PME处理浓度为25 μg/ml；PME50组：PME处理浓度为50 μg/ml；PME100组：PME处理浓度为100 μg/ml；PME200组：PME处理浓度为200 μg/ml；PME400组：PME处理浓度为400 μg/ml。PNS+PME组：加入同一浓度PME的同时(100 μg/ml)，加入不同浓度的PNS，根据PNS浓度的不同分为不同的亚组，PNS0组：PNS处理浓度为0 μg/ml；PNS25组：PNS处理浓度为25 μg/ml；PNS50组：PNS处理浓度为50 μg/ml；PNS100组：PNS处理浓度为100 μg/ml；PNS200组：PNS处理浓度为200 μg/ml。加入不同物质后继续培养12 h，检测评估指标。

1.2.2评估指标 (1)细胞活性采用CCK-8法检测细胞活性，CCK-8试剂盒购自日本同仁化学，按照说明书操作，计算细胞活性率。(2)细胞凋亡率采用流式细胞术检测细胞凋亡率，Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自美国BD Pharmingen。收集细胞(1×105个细胞)用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化后，用PBS洗涤后加入Annexin V-FITC，避光、室温孵育15 min后加入碘化丙啶，流式细胞仪检测细胞凋亡率。(3)细胞活性氧簇(ROS)生成采用氧化敏感的氟探针2′，7′-二氯荧光素二乙酸盐(DCFH-DA，试剂盒购自中国大连美仑生物)。弃去细胞培养液加入DCFH-DA，室温孵育30 min，收集细胞，采用流式细胞仪检测二氯荧光素阳性细胞。(4)氧化应激指标的检测收集细胞，离心(5 000 r/min，5 min)，收集上清，分别采用SOD、MDA和GSH-Px试剂盒分别检测SOD、MDA和GSH-Px水平。(5)细胞凋亡相关基因的表达细胞凋亡相关基因半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(caspase)mRNA的检测。收集细胞，采用TRIZOL法提取细胞RNA，反转录后进行实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测caspase-3、caspase-9的mRNA含量。caspase-3-正义链：5′-CCGGAGTCTGACTGGAAAGCC-3′；caspase-3-反义链：5′-GCATACAGGAAGTCGGCCTCC-3′;caspase-9-正义链：5′-ATACACCCTGGACTCGGATCC-3′；caspase-9-反义链：5′-TGCTGAAGCTTCTCACAGTCC-3′。

1.3统计学处理 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析，作图采用Graphpad prism6.0进行作图分析。

2 结 果

2.1体内实验

2.1.1各组体重变化 对照组和PNS组体重增长平缓，PME组体重在试验期间无显著变化，PNS和PME共同处理小鼠7 d内体重增长较慢，7～14 d内体重增长加快，见表1。

表1 各组小鼠体重变化

2.1.2各组肾功能指标比较 PME组肾系数、BUN、CRE均显著大于其他3组(P<0.05)，PNS+PME组各项肾功能指标均接近对照组正常肾功能指标，见表2。

表2 各组肾功能及肾组织氧化性损伤指标的比较

2.1.3各组肾组织氧化性损伤 PME组肾组织中SOD及GSH-Px水平均显著小于其他3组，MDA值显著大于其他3组(P<0.05)，见表2。

2.1.4各组肾脏组织病理学变化 不同处理组小鼠肾脏组织切片，PNS组肾脏组织无明显异常，PME组可见肾小管扩张、水肿，间质增大，炎性细胞浸润，管型形成，伴有轻微的肾小管上皮细胞坏死等。经PNS+PME处理的小鼠，肾脏组织有了明显的改善，但仍有轻微的肾小管扩张、水肿，见图1。

图1 各组肾脏组织病理学变化(HE染色，×200)

2.2体外实验

2.2.1PME 作用于TCMK-1细胞活性变化以对照组细胞活性率作为参照(100%)，不同PME浓度对细胞活性的影响不同，随着PME浓度的升高，细胞活性逐渐降低，PME25组细胞活性为(112.42±9.17)%、PME50组细胞活性为(104.28±8.87)%、PME100组细胞活性为(82.64±7.80)%、PME200组细胞活性为(59.62±8.13)%、PME400组细胞活性为(59.55±8.06)%。

2.2.2PNS对PME处理细胞活性、氧化应激及caspase活性的影响 经同一浓度PME和不同PNS浓度处理的细胞，随着PNS浓度的增加，细胞活性逐渐上升，凋亡率逐渐下降；随着PNS浓度的增加，ROS、MDA逐渐减小，与对照组间的差距越来越小，SOD、GSH-Px逐渐增大，与对照组间的距离越来越小；随着PNS浓度的增加，细胞凋亡相关基因caspase-3、caspase-9 mRNA含量均逐渐减小，与对照组间的距离越来越小，见表3。

表3 PNS对PME处理细胞细胞活性、氧化应激及caspase活性的影响

3 讨 论

近年来，细菌耐药性问题越来越普遍，但是新的抗生素开发速度缓慢，尤其是多耐药革兰阴性菌如鲍曼不动菌的出现，已成为临床亟待攻克的难关。伤口感染、尿路感染、败血症及呼吸系统疾病病例数目越来越庞大，PME的使用愈发广泛，但是PME导致的肾毒性发生率高达60%，严重限制了其临床应用〔8〕。PME导致的肾毒性机制目前尚缺乏明确的结论，但是研究〔9，10〕表明，氧化损伤加剧及caspase介导的细胞凋亡级联通路被激活与肾毒性的发生机制有关。本研究结果表明PME有肾毒性作用，PNS可有效缓解PME导致的肾毒性作用。

有研究〔11〕表明，PNS主要成分包括三七皂苷、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1。三七皂苷可减轻大鼠的肾脏缺血再灌注损伤，人参皂苷可发挥抑制氧化应激作用，人参皂苷Rb1通过抑制丝裂原激活的蛋白激酶、激活胱天蛋白酶达到减缓他克莫司引起的肾毒性〔12〕。本研究结果表明，PME诱导的小鼠肾功能损伤，同时接受PNS处理后，其肾功能指标显著改善，与文献〔13〕结论一致。氧化应激指的是抗氧化防御系统产生的ROS失衡导致的氧化损伤，ROS是氧化还原反应过程中产生的一系列化合物的总称，具有化合物活性，可破坏DNA、酶及蛋白质等，受到外界干扰平衡被打破，则导致氧化损伤〔14〕，可能与肾毒性的发生机制间存在关联。体内ROS的清除系统包括酶和非酶两种途径，酶类抗氧化物包括SOD、GSH-Px等，非酶抗氧化物包括维生素E、维生素C等。SOD由蛋白质和金属离子组成，具有特定的生物催化功能，可有效清除内源性或外源性超氧自由基，具有重要的抗氧化作用〔15〕。GSH-Px主要分布于细胞质和线粒体中，可有效发挥消除生物大分子过氧化物作用，保护细胞膜的结构和功能免受过氧化物的破坏〔16〕。MDA是由脂质过氧化物降解形成的一组醛，检测其含量通常可反映脂质过氧化的程度〔17〕。本研究结果提示，PNS可有效缓解PME导致的氧化损伤，PNS可有效改善小鼠的抗氧化系统，增强小鼠的清除自由基能力。一项体外研究〔18〕结果表明，经PME诱导的肾毒性细胞模型中，经PNS处理后ROS、MDA水平降低，SOD、GSH-Px活性及GSH含量均显著升高，与本研究结论一致。

细胞凋亡指的是在基因调节下，细胞自主、有序的主动死亡过程，凋亡信号转导包括两种主要途径：死亡受体途径和线粒体途径〔19〕。PME引起的肾毒性可能是由于其在肾小管细胞线粒体中累积，导致氧化应激失衡。caspase-3、caspase-9参与细胞凋亡线粒体途径的级联反应，本研究结果显示，经PME处理的TCMK-1细胞，caspase-3、caspase-9活性显著升高，可能与线粒体膜电位发生变化，从而导致线粒体膜的通透性发生改变，使得Caspase蛋白家族介导的级联通路被激活，使得细胞凋亡。添加PNS处理的PME诱导的TCMK-1细胞，caspase-3、caspase-9水平随着PNS浓度的增加显著降低。综上，三七总皂苷可通过缓解氧化应激反应及细胞凋亡，达到有效减轻PME诱导的小鼠肾毒性，联合使用三七总皂苷和PME可能用于临床革兰阴性菌感染。