非布司他对高尿酸血症大鼠p38 MAPK/NF-κB通路及脑血管粥样硬化的影响

李芳 姚嘉怡 姚建华 曹京旌 宁晓然

(1河北省人民医院风湿免疫科，河北 石家庄 050000；2华北理工大学冀唐学院中医系；3河北医科大学第二医院老年病科)

高尿酸血症(HUA)为一种因尿酸代谢功能障碍引起的慢性代谢疾病，可因尿酸盐沉积而导致关节痛风发作和尿酸性肾结石，并可引起血管内皮功能异常、动脉粥样硬化、血管钙化等心血管功能异常〔1，2〕。研究表明，HUA与脑血管粥样硬化有着密切联系〔3〕，而尿酸诱导的氧化应激及炎症反应是造成脑血管粥样硬化的主要病理基础，清除氧自由基，抑制炎症是对抗上述血管损伤的一种有效治疗方法〔4，5〕。p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核转录因子(NF)-κB可调控机体炎症及氧化应激过程，尿酸可增强p38 MAPK的磷酸化，进而激活NF-κB信号，促使其核转移及促炎因子表达，诱导血管平滑肌细胞炎症；抑制p38 MAPK/NF-κB激活，可减少活性氧产生，降低炎症因子表达，减轻动脉血管炎症损伤，改善动脉粥样硬化〔6，7〕。因此推测，p38 MAPK/NF-κB信号是治疗HUA大鼠脑血管粥样硬化的主要作用靶点。非布司他作为一种黄嘌呤氧化酶抑制剂，是临床中用于治疗HUA的一线药物，可降低尿酸水平，对于慢性肾病HUA患者疗效确切，安全可靠〔8，9〕，但非布司他对HUA大鼠p38 MAPK/NF-κB通路与其脑血管粥样硬化的影响，目前还尚未有明确阐述，本文以不同剂量非布司他处理HUA模型大鼠，对此课题进行探讨。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 清洁级Wistar大鼠购自南方医科大学，许可证号为SCXK(粤)2016-0041，雄性，体重200～220 g。在河北省人民医院动物房中严格参照《关于善待实验动物的指导性意见》饲养，室内环境保持清洁级，噪音不超过80 dB，通风良好，温度25℃，相对湿度55%，饲养适应1 w后进行实验。

1.1.2试剂与仪器 非布司他片(规格：40 mg/片)，生产厂家：江苏万邦生化医药股份有限公司，国药准字：H20130058；别嘌醇片(规格：0.1 g/片)，生产厂家：上海信谊万象药业股份有限公司，国药准字：H31020334；超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒、丙二醛(MDA)检测试剂盒，生产厂家：上海晶抗生物工程有限公司，货号：JK-(a)-2293、JK-(a)-2197；兔源p38 MAPK、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、NF-κB p65、磷酸化(p)-p38 MAPK及增殖细胞核抗原(PCNA)一抗、大鼠白细胞介素(IL)-6及肿瘤坏死因子(TNF)-α酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、耦联辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗兔二抗，生产厂家：美国Abcam公司，货号：ab181602、ab1194、ab16502、ab17942、ab18197、ab100772、ab5603、ab205718；苏木素-伊红(HE)染色试剂盒，生产厂家：北京金克隆生物技术有限公司，货号：RS3390；氧嗪酸钾，生产厂家：上海源叶生物科技有限公司，货号：S17112；BCA试剂盒、蛋白裂解液，生产厂家：上海碧云天公司，货号：P0011、P0013B等。SHE-3000酶标仪，生产厂家：北京赛尔福知心科技有限公司；KEEBIO-600N电泳仪电源、KEEBIO-HE120水平电泳槽、转移电泳槽KEEBIO-VE186，生产厂家：上海金鹏分析仪器有限公司；SD-1全自动生化分析仪，生产厂家：成都斯马特科技有限公司；HM355S全自动轮转式石蜡切片机，生产厂家：上海涵飞医疗器械有限公司；37XF-PC倒置生物显微镜，生产厂家：上海永亨光学仪器制造公司；WD-9413B化学凝胶成像仪，生产厂家：济南来宝医疗器械有限公司等。

1.2方法

1.2.1大鼠HUA模型制备及分组给药 遵循文献〔10〕中方法，将氧嗪酸钾溶于蒸馏水中，并拌入大鼠饲料中，使氧嗪酸钾占饲料的质量分数为2%。然后以2%的氧嗪酸钾饲料喂养65只大鼠，6 w后进行血清尿酸水平检测，当明显高于正常饲料喂养大鼠时，即表明HUA模型构建成功，共成功构建模型60只，随机分为M组、FX-L组、FX-M组、FX-H组、Allo组，每组12只模型大鼠，另取12只大鼠以正常饲料喂养同样时间，设为NC组。

以生理盐水溶解非布司他片及别嘌醇片，配制为0.1、0.2、0.4 mg/ml的非布司他〔11〕溶液和2.4 mg/ml的别嘌醇〔12〕溶液，FX-L组、FX-M组、FX-H组与Allo组大鼠分别以上述溶液10 ml/kg的剂量灌胃，M组和NC组以10 ml/kg的生理盐水灌胃，每天1次，持续21 d。

1.2.2标本采集及脑血管病理形态检测 末次用药后24 h，吸入乙醚麻醉大鼠，解剖、开腹，经腹主动脉取血3 ml，4℃，3 000 r/min，离心15 min，吸出上清即能得到各组血清，于-80℃冰箱中储存备用；将各组大鼠断头取出大脑，分离动脉血管，剪取约0.5 cm漂洗后，置于4%多聚甲醛溶液中固定，剩余血管储存在液氮中备用。将固定后的脑血管组织依次浸入75%、90%、95%、100%浓度的梯度酒精中进行脱水，取出切片浸入二甲苯中孵育透明后置于热石蜡中包埋，将得到的石蜡组织块放入切片机中做常连续切片，得到厚度约为5 μm的切片备用。

1.2.3大鼠血清尿酸、TNF-α及IL-6水平测定和脑血管组织中氧化应激水平检测 将1.2.2中储存于-80℃冰箱中的血清置于冰水浴中解冻，以全自动生化分析仪检测其中尿酸含量，参照ELISA试剂盒说明书的操作步骤测定其中TNF-α、IL-6含量。

分别将1.2.2中的各组脑血管组织剪碎，与蛋白裂解液混匀后匀浆，每个样品取出一半匀浆液提取总蛋白，剩余一半匀浆液提取核内蛋白，运用BCA法分别测定总蛋白和核内蛋白浓度，步骤具体参照制造商说明书指导操作，每组各取500 μl总蛋白样品液，使用检测试剂盒并遵照其制造商说明书指导测得其中SOD、MDA水平，剩下的总蛋白和核内蛋白样品液后续做蛋白表达检测实验。

1.2.4脑血管组织p38 MAPK/NF-κB通路相关蛋白表达检测1.2.3中剩余的蛋白样品液，根据蛋白浓度测定结果将其调至各组相同，每组总蛋白和核内蛋白样品液各取15 μl，变性蛋白后上样跑十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，通过湿转将分离胶中全部蛋白移至PVDF膜，将膜浸入5%脱脂奶粉溶液中室温孵育2 h，对蛋白非特异抗原进行封闭处理，然后分别以兔源GAPDH、p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65、PCNA一抗溶液4℃孵育过夜，稀释比例均为1：2 000，TBST漂洗3次后将各蛋白膜浸入耦联HRP的山羊抗兔二抗溶液(稀释比例为1∶1 000)，室温孵育2 h后TBST漂洗3次，于膜上滴加增强化学发光试剂对显色蛋白条带，在凝胶成像仪中采集各组蛋白条带图像，并运用Image-J软件分析图片，定量各组蛋白灰度值后量化得到其相对表达量。

1.3统计学分析 采用软件SPSS26.0进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1非布司他对大鼠血清尿酸的影响 与NC组相比，M组血清尿酸明显升高(P<0.05)；与M组相比，FX-L、FX-M、FX-H组及Allo组血清尿酸明显降低(P<0.05)，且FX-L、FX-M、FX-H组之间呈剂量依赖性(P<0.05)；FX-H组与Allo组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2非布司他对大鼠血清中TNF-α与IL-6水平的影响 与NC组相比，M组血清中TNF-α与IL-6水平明显增高(P<0.05)；与M组相比，FX-L、FX-M、FX-H组及Allo组大鼠血清中TNF-α与IL-6水平显著降低(P<0.05)，且FX-L、FX-M、FX-H组之间呈剂量依赖性(P<0.05)；FX-H组与Allo组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.3非布司他对大鼠脑血管组织氧化应激的影响 与NC组相比，M组脑血管组织SOD水平显著降低(P<0.05)，MDA水平显著升高(P<0.05)；与M组相比，FX-L、FX-M、FX-H组及Allo组大鼠脑血管组织SOD水平均升高，MDA水平均降低，且FX-L、FX-M、FX-H组之间呈剂量依赖性(P<0.05)；FX-H组与Allo组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组血清尿酸、TNF-α、IL-6、SOD、MDA水平及脑血管组织p38 MAPK/NF-κB通路相关蛋白表达比较

2.4非布司他对大鼠脑动脉血管病理形态的影响 NC组脑动脉血管形态完好清晰，无损伤；M组脑动脉可见血管平滑肌细胞增生，内膜增厚，腔内可见向里凸起的斑块，并发生变性坏死，血管壁损伤等病理损伤；与M组相比，FX-L、FX-M、FX-H组及Allo组脑动脉血管上述病理损伤减轻，且随非布司他剂量升高而逐渐减轻；FX-H组与Allo组相比，脑动脉血管上述病理损伤减轻程度无明显差异，见图1。

图1 各组脑动脉血管HE染色结果(×200)

2.5非布司他对大鼠脑血管组织p38 MAPK/NF-κB通路相关蛋白表达的影响 与NC组相比，M组脑血管组织p38 MAPK/NF-κB通路相关蛋白p-p38 MAPK/p38 MAPK、核内NF-κB p65表达明显增高(P<0.05)；与M组相比，FX-L、FX-M、FX-H组及Allo组大鼠脑血管组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、核内NF-κB p65表达明显降低(P<0.05)，且FX-L、FX-M、FX-H组之间呈剂量依赖性(P<0.05)；FX-H组与Allo组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1、图2。

图2 免疫印迹检测各组大鼠脑血管组织p38 MAPK/NF-κB通路相关蛋白表达

3 讨 论

近年来，随着社会发展及生活水平的提高，人们膳食结构发生很大改变，HUA的患病率随之明显增加，且患者呈明显年轻化趋势〔13，14〕。研究发现，尿酸可减少一氧化氮(NO)合成，诱导炎症及氧化应激反应，损伤血管，促使血管钙化，最终导致动脉粥样硬化，是引发心血管疾病的独立危险因素〔15，16〕。本文结果表明高血酸可引发严重的炎症及氧化应激反应，损伤HUA大鼠脑动脉血管。

非布司他是一种黄嘌呤氧化酶抑制剂，可通过减少血清尿酸含量达到治疗HUA的目的，对尿酸性肾病患者有明显肾脏保护作用，能明显改善其肾动脉粥样硬化程度，还可减轻痛风患者关节炎症状〔2，17〕，但非布司他对脑血管粥样硬化的影响，鲜有报道。别嘌醇是临床及基础研究中探索HUA治疗方法及机制的常用阳性对照药。本文结果表明非布司他可减少HUA大鼠血清尿酸含量，抑制炎症发生发展，降低氧化应激水平，减轻脑动脉血管损伤，改善脑血管粥样硬化症状，并随剂量升高而作用增强。

p38 MAPK/NF-κB是机体内调控细胞迁移、增殖、衰老及凋亡、炎症、脂质过氧化反应等生理病理过程的重要信号，在急性呼吸窘迫综合征大鼠肺组织中，处于激活状态，此时，p38 MAPK发生磷酸化，NF-κB大量转入核内，介导下游炎症因子表达，促使炎症进展，加重肺组织损伤，而阻滞p38 MAPK/NF-κB传导，可抑制炎症反应，减轻肺组织损伤〔18〕。另外p38 MAPK/NF-κB信号还可介导尿酸诱导的血管组织炎症及过氧化损伤过程，抑制该信号传导，可阻止炎症与过氧化反应发生与发展，减轻动脉血管粥样硬化症状〔6，7，19〕。本文结果表明p38 MAPK/NF-κB参与介导HUA大鼠脑血管粥样硬化病理过程，非布司他可下调该信号表达，降低血清尿酸水平，改善HUA大鼠脑血管粥样硬化症状。

综上，非布司他可抑制尿酸合成，减轻p38 MAPK磷酸化，阻止NF-κB p65核转移，降低炎性细胞因子TNF-α、IL-6合成分泌，抑制炎症及氧化应激发生发展，减轻脑血管病理损伤，缓解HUA大鼠脑血管粥样硬化症状，阻滞p38 MAPK/NF-κB信号传导可能是其药理机制之一。但本文只进行了初步研究，证据效力不足，还需通过使用p38 MAPK/NF-κB信号激活剂和抑制剂来进行对照验证。