黄芪甲苷联合西格列汀对糖尿病大鼠糖脂代谢、氧化应激及TGF-β1/PI3K/Akt信号通路的影响

邓锦满 胡润凯 韩伟超 何淑芬 谢保城 丁少波

(南方医科大学附属东莞市人民医院药学部，广东 东莞 523059)

近几十年来，随着人们的生活水平变化，我国的糖尿病(DM)患者越来越多，其发病率仅次于肿瘤及心血管疾病，在慢性疾病中排名第三位〔1〕。DM是由先天性或后天因素引起的胰岛功能障碍或胰岛素抵抗引起的一种常见的代谢性疾病，以机体高血糖、高脂血症、胰岛素缺乏或胰岛素抵抗为特征〔2〕。黄芪甲苷是中药黄芪的有效成分，研究表明其具有丰富的药理活性，如抗炎、免疫调节、抗糖尿病、肾脏保护及抗氧化应激等〔3〕，常用于治疗DM引起的并发症，如肾脏损伤，其机制可能与转化生长因子-β1/白细胞抑制因子(TGF-β1/Smad)通路密切相关〔4,5〕。目前，西格列汀在临床上广泛用于治疗2型糖尿病(T2DM)，它是一种二肽基肽酶(DPP)-4抑制剂，通过减少胰高血糖素样肽(GLP)-1失活，刺激胰岛素分泌发挥降血糖作用〔6〕。研究发现，西格列汀除降血糖作用外，还可能通过磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路改善胰岛素抵抗、肾脏受损等〔7〕，而胰岛素主要通过PI3K/Akt信号通路发挥调节血糖的作用，该信号通路异常是与T2DM发生发展息息相关〔8〕。随着我国传统中医药的发展，中西药结合治疗DM在临床上应用越来越广泛，其临床效果也受到越来越多的肯定〔9,10〕，然而其中的具体药理作用及理论机制尚不明确，本实验研究中药单体黄芪甲苷联合西格列汀治疗T2DM模型大鼠，并基于TGF-β1/PI3K/Akt信号通路探究其中的作用机制治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1材料 SPF级雄性健康SD大鼠共55只，体质量为(190±20)g，购于南方医科大学实验动物中心；动物许可证号：SCXK(粤)2016-0041。磷酸西格列汀片，规格：100 mg×14片，批号：S025217，澳大利亚默沙东制药公司生产。黄芪甲苷粉末，批号：170768，纯度≥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司生产。链脲佐菌素(STZ),Sigma公司；总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；丙二醛(MDA)；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒(Omega公司)；蛋白提取试剂盒(南京凯基生物科技公司)，兔抗大鼠β-actin 单抗(英国 Abcam 公司)；山羊抗兔二抗(武汉三鹰生物技术有限公司)，兔抗大鼠磷酸化(p)-PI3K,p-Akt多抗(英国 Abcam 公司) 。罗氏卓越精采型血糖仪(德国罗氏诊断有限公司)、卓越310型全自动生化分析仪(武汉精诚伟业医疗设备有限公司)、电泳仪(天能 VE-180)、synergy2多功能酶标仪(美国Bio Tek仪器有限公司)、实时荧光定量PCR仪(美国Thermo)、MIKRO220型超速低温离心机(德国 Hettich 公司)、FA1004 型电子天平(上海天平仪器厂)、Tanon 5200 Multi成像系统(上海天能)。

1.2动物造模、分组及给药 大鼠进行标准饲养1 w后，采用数字随机法分为5组，每组11只。正常组继续采用标准饲养，造模组给予高糖高脂饲料喂养6 w后，采取腹腔注射STZ(60 mg/kg)，复制T2DM模型，注射72 h后，尾静脉采血，血糖仪测血糖，随机血糖>16.7 mmol/L为造模成功标准〔5〕。剔除血糖未达标的5只大鼠，将造模成功后的39只大鼠随机分为黄芪甲苷组(n=10)、西格列汀组(n=10)、黄芪甲苷+西格列汀组(n=9)、模型组(n=10)，分别灌胃给予黄芪甲苷〔60 mg/(kg·d)〕、西格列汀〔10 mg/(kg·d)〕，黄芪甲苷〔30 mg/(kg·d)+西格列汀〔5 mg/(kg·d)〕及同体积生理盐水，连续8 w。

1.3大鼠体重、血糖指标检测 最后一次给药后，大鼠先禁食不禁水12 h,测量体重，采用剪尾取血法采取大鼠尾根部血。大鼠空腹血糖(FPG)采用葡萄糖氧化酶法检测，空腹胰岛素(FINS)、糖化血红蛋白(HbA1c)采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。

1.4大鼠血脂指标水平检测 最后一次给药后，腹腔注射水合氯醛(30 mg/kg)，大鼠麻醉后，经腹主动脉取血，4℃，3 500 r/min，离心15 min，取上清，放于-40℃冰箱保存。用全自动生化分析仪检测大鼠TC、TG、HDL-L、LDL-L水平。

1.5大鼠肾脏氧化应激指标测定 大鼠麻醉取血后，快速剖腹取出大鼠两侧肾脏，分别保存于4%多聚甲醛中，用于后续检测。实验时，用生理盐水将肾脏组织冲洗干净，剪碎，加入适量裂解液，摇匀，采用Omega公司的试剂盒检测MDA；SOD、GSH-Px，实验步骤严格按照说明书进行。

1.6采用RT-PCR 法检测大鼠肾组织 TGF-β1、PI3K、Akt基因的表达 取肾脏组织，先提取总RNA，检测含量鉴定合格后，按试剂盒说明将RNA反转录为cDNA，PCR法反应扩增PI3K、Akt基因产物，每个指标重复 3 次，以β-actin为内参采用2-△△Ct法计算所得数据，作为目的 mRNA 的相对表达水平。引物由深圳华大基因公司进行合成，其中TGF-β1引物序列为：上游5′-CCAAGGAGACGGAATACAGG;下游 5′-GTGTTGGTTGTAGAGGGC-AAG-3′；PI3K的引物序列为：上游5′-CATCACTTCCTCCTGCTCTAT-3′；下游5′-CAGTTGGTTGGCAAT-CTTCTTC-3′；Akt的引物序列为：上游5′-AAACCTGGCGGCCACGCTAC-3′；下游5′-TTGGCCAGGGCCACCTCCAT-3′，β-actin 引物序列为：上游5′-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3′；下游5′-TAATGTCACGCACGATTTCC-3′。

1.7Western印迹检测大鼠肾脏TGF-β1、PI3K、AKT蛋白含量 取大鼠肾脏组织作为样品，往各样品加入1 ml配好的RIPA裂解液，在冰上充分裂解后提取总蛋白，按照BCA试剂盒说明书测定蛋白浓度，再根据蛋白浓度计算上样量。按照配胶、电泳、转膜、封闭的顺序进行实验，最后将蛋白条带放置在Tanon 5200 Multi成像系统中进行曝光成像。以β-actin为参考，用软件Image J计算灰度值。

1.8统计学处理 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验、独立样本t检验。

2 结 果

2.1各组体重、血糖指标比较 正常组反应灵敏，活动正常。与正常组相比，造模成功后，模型组出现典型多饮、多食、多尿的症状，体重明显减轻，FPG、HbA1c水平显著升高，FINS水平显著降低(P<0.01)；与模型组比较，黄芪甲苷组、西格列汀组、黄芪甲苷+西格列汀组的“三多一少”症状均有不同程度缓解，体重、FINS水平升高，FPG、HbA1c水平降低，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；与黄芪甲苷组和西格列汀组相比，黄芪甲苷+西格列汀组体重、FINS水平显著更高，FPG、HbA1c水平显著更低(P<0.05)。见表1。

2.2各组TGF-β1、PI3K、Akt mRNA比较 与正常组相比，模型组TGF-β1 mRNA明显升高，而PI3K、Akt mRNA明显下降(P<0.01)；与模型组相比，黄芪甲苷组+西格列汀组的TGF-β1 mRNA水平显著下降，黄芪甲苷组、西格列汀组、黄芪甲苷组+西格列汀组的PI3K、Akt mRNA水平显著升高；与黄芪甲苷组和西格列汀组相比，黄芪甲苷+西格列汀组TGF-β mRNA显著减少，PI3K及Akt mRNA显著增加(P<0.05，P<0.01)。见表1。

表1 各组体重、血糖指标及TGF-β1、PI3K、Akt mRNA比较

2.3各组血脂水平比较 与正常组比较，模型组血脂数据均出现显著异常(P<0.01)。与模型组相比，黄芪甲苷组、西格列汀组、黄芪甲苷+西格列汀组TC、TG、LDL-C水平显著降低，黄芪甲苷+西格列汀组HDL-C水平显著升高(P<0.05，P<0.01)，而黄芪甲苷组、西格列汀组HDL-C水平未见明显变化(P>0.05)；与黄芪甲苷组和西格列汀组相比，黄芪甲苷+西格列汀组TC、TG、LDL-C水平显著更低，HDL-C水平显著升高(P<0.05)。见表2。

2.4各组氧化应激水平比较 与正常组对比，模型组MDA水平显著升高，SOD、GSH-Px的水平显著降低(P<0.01)；与模型组相比，黄芪甲苷组、西格列汀组、黄芪甲苷+西格列汀组MDA显著降低，SOD显著升高，而西格列汀组、黄芪甲苷+西格列汀组GSH-Px水平显著升高(P<0.05，P<0.01)。与黄芪甲苷组和西格列汀组相比，黄芪甲苷+西格列汀组MDA更低，GSH-Px更高(P<0.05)，SOD无明显变化(P>0.05)。见表2。

表2 各组给药后血脂及氧化应激水平比较

2.5各组肾脏组织TGF-β1、PI3K、Akt蛋白表达水平 与正常组相比，模型组TGF-β1、p-PI3K、p-Akt蛋白水平显著升高，PI3K、Akt显著下降(P<0.01)；与模型组相比，黄芪甲苷组与西格列汀组TGF-β1蛋白水平无明显变化(P>0.05)，黄芪甲苷+西格列汀组可显著降低TGF-β1蛋白表达(P<0.01，P<0.05)。与模型组比较，黄芪甲苷组PI3K蛋白水平升高，p-Akt蛋白水平降低，而西格列汀组PI3K、Akt蛋白水平均升高，p-PI3K、p-Akt蛋白水平均降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。联合给药组与单独给药组及模型组相比，PI3K、Akt蛋白水平显著增高，TGF-β1、p-PI3K、p-Akt蛋白水平显著降低(P<0.05，P<0.01)。见表3和图1。

表3 各组肾脏组织蛋白表达水平比较

1～5：正常组，模型组，黄芪甲苷组，西格列汀组，黄芪甲苷+西格列汀组图1 各组肾脏组织TGF-β1、PI3K、Akt蛋白表达

3 讨 论

T2DM占DM患者的90%～95%，主要是由内源性分泌的胰岛素无法完全对抗机体本身对胰岛素的抵抗(IR)引起的〔11〕。胰岛素主要通过PI3K/Akt信号通路发挥调节血糖作用的，在机体进食后，胰岛β细胞产生的胰岛素释放入血，影响肝细胞膜表面的胰岛素受体，激活其β受体亚基中的磷酸化酪氨酸〔12〕，然后激活PI3K。Akt被激活后继续通过下游分子的生物效应发挥代谢调节作用〔13〕。糖尿病肾病(DN)是DM常见的并发症，其中约35%的DM患者可发生肾脏损伤〔14〕。作为“最强的转化因子”的TGF-β1在肾脏中具有高度表达，也是介导肾小球硬化的主要细胞因子〔15〕。研究表明，TGF-β1过度表达，可激活PI3K/Akt信号通路,介导肾小管上皮-间充质转分化〔16〕。TGF-β1/PI3K/Akt信号通路出现异常与T2DM及DN的发生发展息息相关。

目前，DM的药物包括胰岛素、二甲双胍、促胰岛素分泌素药物、胰岛素增敏剂等。其中，西格列汀是用于治疗T2DM的DPP-4抑制剂，能够有效降低血糖〔17〕。报道显示，西格列汀还可以有效保护DM大鼠肾脏〔18〕，改善肾功能〔19〕，其机制可能与PI3K/Akt信号通路有关〔16,20，21〕。临床上经常联合使用西药与含有黄芪的益气中药复方治疗DM，而黄芪甲苷是黄芪的主要有效成分之一。冯小南等〔22〕表明黄芪消渴方与胰岛素联合治疗新诊断的T2DM患者临床疗效较好、安全性较高，且患者的依从性比单纯的胰岛素治疗好。刘曙艳等〔23〕研究者发现黄芪与降压药缬沙坦联合治疗DN，能够有效降低患者的尿亮氨酸氨基肽酶(LAP)和足细胞标志蛋白(PCX)水平及明显改善患者的临床症状。然而，对于黄芪甲苷单体联合西药治疗DM方面的研究仍然较少，其中的作用机制仍不清晰。

本研究结果表明药物联合应用的机制可能是通过共同激活PI3K/Akt通路，进一步改善大鼠糖脂代谢及降低氧化应激。刘长青等〔24〕的研究结果发现黄芪甲苷联合氯沙坦通过提高 PI3K及Akt蛋白的水平，从而改善DM大鼠的氧化应激和肾损伤，且联合给药疗效同样优于单独给药组，与本实验的研究结果相似。不同的是，黄芪甲苷与西格列汀单独给药对TGF-β1蛋白水平无明显的影响，而联合给药组可以明显降低其蛋白水平，表明联合给药可能通过抑制TGF-β1表达，激活了PI3K/Akt通路。刘晨旭等〔14〕报道称黄芪甲苷在高糖诱导下，能够抑制肾小球系膜细胞(MCs)的过度增殖，通过调控TGF-β1/Smad信号通路保护大鼠肾脏。研究发现西格列汀在早期DN应用降低血清趋化素(chemerin)与TGF-β1水平，从而改善临床患者的肾功能。相比之下，本实验未设置各给药组内的浓度梯度实验，因此，黄芪甲苷组与西格列汀单独给药对TGF-β1蛋白水平改变无统计学意义，可能与药物浓度低于有效浓度有关。

综上，联合应用西格列汀和黄芪甲苷治疗DM疗效好，其机制可能与TGF-β1/PI3K/Akt蛋白信号通路相关，但具体结果仍需在临床上及更全面的基础实验中进一步证明及探究。