四黄油对糖尿病大鼠烫伤创面皮肤组织CD146、VEGF表达及肉芽组织血管密度的影响

黄卫虎 徐燕 孙朝越 张玮 王霞

(1吉安市中心人民医院医学美容科,江西 吉安 343000;2井冈山大学附属医院检验科;3井冈山大学医学部)

糖尿病合并烫伤不仅给患者带来了巨大的精神压力，同时严重损害患者的生活质量并造成经济负担〔1〕。尽管已证明负压引流、抗感染敷料和生长因子可部分改善烫伤创面的愈合，但专注于最小化伤口或促进细胞增殖的单一治疗方法仍无法获得令人满意的结果。伤口修复是一个复杂而有序的生物学过程，包括止血、炎症反应、细胞增殖和组织重塑〔2〕。在任何一个阶段中出现问题都可能延迟伤口愈合。糖尿病患者的高血糖微环境很可能导致与愈合相关的生长因子分泌减少，导致成纤维细胞增殖减少，这是延迟糖尿病溃疡愈合的最有害因素之一〔3，4〕。血管内皮生长因子(VEGF)在调节伤口修复、胚胎发育、血管生成和神经修复中起重要作用〔5〕。有研究〔6～8〕表明，当上皮组织受损时，VEGF在伤口表面过度表达，刺激成纤维细胞、胶原蛋白和结缔组织积聚到伤口部位，从而产生新组织并促进伤口愈合。在糖尿病慢性溃疡中，高葡萄糖水平通常会诱发过多的炎症因子的产生，从而导致炎症反应延长，由于炎症渗出物的积累而破坏伤口的微环境及细胞损伤。CD146是血管形成的重要标志，新生血管的CD146呈高表达，抗CD146抗体标记能很好地区分新生血管和成熟血管，根据CD146表达计算出的微血管密度(MVD)是新生血管形成的量化指标〔9〕。研究表明〔10～12〕，细胞黏附分子CD146是肿瘤新生血管的标志物分子，能够促进VEGF信号这一血管生成中最为重要的信号通路的传导，进而促进血管生成。同时，CD146在调节炎症方面显示出优异的功效。就相应的作用机制而言，CD146通过抑制核转录因子(NF)-κB信号通路来抑制巨噬细胞介导的炎症反应。因此，使用CD146改善炎症微环境，结合VEGF促进细胞增殖，可能代表一种有效的治疗方法，可促进糖尿病性溃疡患者的伤口愈合。四黄油由四黄(黄连、黄柏、黄芩和黄杞子)、红花、血蝎、白芷、等中药浸泡于香油，经煎煮提炼而成。它有独特的多功能，并且已被证明具有良好的生物相容性和低刺激性。使用四黄油治疗慢性皮肤溃疡的优势包括其对水和气体的双向渗透性及其是防止细菌入侵和感染的有效屏障。另外，四黄油显示出良好的可塑性和黏附性，从而延长了药物在皮肤表面上的停留时间。本研究探讨四黄油对糖尿病大鼠烫伤皮肤组织CD146、VEGF表达及肉芽组织血管密度的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料 24只雄性SPF级SD大鼠，7～9周龄，体重210～240 g，购自湖南斯莱克景达实验动物公司。动物生产许可证号码为：SCXK(湘)2009-0004。为所有大鼠自适应地在笼子中提供饮用水和固体鼠粮。室温约23℃，相对湿度为60%，光/暗周期为12 h/12 h。所有大鼠适应性饲养4 w，在此期间测量并记录血糖水平。

1.2糖尿病模型建立及烫伤创面制备 ①建立大鼠糖尿病模型：腹腔内一次性注射经柠檬酸缓冲液稀释的链脲佐菌素(STZ)55 mg/kg；注射后每日检测血糖，当血糖>13.3 mol/L(基础血糖<8.9 mol/L)，胰腺组织病理学检查证实胰岛细胞已破坏，则表明建模成功。②Ⅱ度烫伤创面制备：糖尿病模型成功建立后1个月，3%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，每只大鼠的背部用脱毛剂脱毛，在脊柱两侧烫伤(每个直径1.0 cm)。烫伤条件如下：热头温度为85℃，作用在皮肤上的力等于0.5 kg重量，持续10 s，伤口不做包扎，将每只大鼠单独隔离，并提供普通饮食。在伤口形成当天开始进行各种治疗。在开始四黄油治疗之前，用过氧化氢对伤口进行适当处理，并用碘伏消毒。

1.3动物分组 将24只深Ⅱ度烫伤糖尿病大鼠随机分为实验组和对照组，每组12只。实验组：烫伤后即刻，创面局部涂抹四黄油。对照组：于相同时间点，创面局部涂抹等量香油。治疗持续31 d。在第7、14、25和31天，使用数码相机为伤口拍照，并通过Image Pro plus V6.0分析伤口的愈合过程。在每个时间点计算伤口愈合率。

1.4Western印迹检测蛋白表达 通过二喹啉甲酸(BCA)试剂对动物或细胞中的蛋白质进行定量，并加入等量的蛋白质(体外40 μg)。将提取的蛋白质与上样缓冲液混合，煮沸并在-20℃保存。另外，将20 μl包含40 μg总蛋白质的蛋白质混合物上样到12%聚丙烯酰胺凝胶上，80 V电泳分离。2 h后，将分离的蛋白质电转到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。随后，使用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜90 min。随后，添加相应的一抗和探针，并将样品在4℃孵育过夜。一抗包括以下抗体：α-SMA、胶原Ⅲ、泛角蛋白、VEGF、CD146、转化生长因子(TGF)-β、白细胞介素(IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α和IL-10。接下来，将样品与相应的二抗(山羊IgG、抗小鼠IgG或与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗兔IgG(1：5 000)在室温下孵育1 h。随后，将PVDF膜用TBST洗涤3次，通过电化学发光(ECL)发光剂检测信号，并通过ChemiDoc XRS + Imaging System(Bio-Rad)捕获结果。最后，通过图像实验室软件分析目标波段灰度值。

1.5免疫荧光 将嵌入OCT的组织冷冻，切成10 μm的厚度，并保存在-20℃下直至进一步使用。将冷冻的载玻片在室温下放置10 min，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤4次(每次洗涤5 min)，并在37℃下用5%(W/V)山羊血清封闭1 h。吸出过量的山羊血清，并将一抗在4℃下孵育过夜。一抗包括：α-平滑肌肌动蛋白(SMA)、Pan-Keratin和CD146，所有抗体都用1%(W/V)山羊血清稀释。第二天，将切片在室温下加热40 min，用PBS清洗4次(每次清洗5 min)，与特定的第二抗体在黑暗中于37℃放置1 h。将切片用PBS洗涤4次(每次洗涤5 min)，并在黑暗中用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色15 min。在PBS中进行4次连续洗涤(5 min/次)后，将抗荧光淬灭剂PVP添加到组织中以密封玻片。使用Leica激光共聚焦显微镜以400倍放大率拍摄每个切片的3个随机区域。通过Image Pro Plus V6.0分析每个图像的平均荧光强度。

1.6MVD计数 以抗CD146抗体对标本进行免疫组织化学染色，操作步骤按SP(生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶)试剂盒说明书进行。根据CD146表达并参照Pareek等〔13〕的方法计算MVD，以此作为新生血管形成的量化指标。

1.7统计学处理 采用SPSS20.0软件进行单因素方差分析或重复测量的方差分析、LSD-t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1四黄油可加速伤口闭合并促进大鼠上皮再形成 与对照组同时间点相比，实验组烫伤皮肤的伤口愈合面积显著增大(P<0.01)。图1显示了2种不同治疗方式在第0、7、14、25、31天的烫伤创面。见表1、图1。第31天，实验组的表皮厚度显著大于对照组(P<0.05)。见图2。

表1 两组不同时间点烫伤皮肤的伤口愈合面积

图1 两组伤口闭合情况

图2 两组第31天上皮组织(HE染色，×100)

2.2四黄油通过增加α-SMA表达来增强肉芽形成 将第31天两组的皮肤组织用于组织学分析。四黄油组的上皮完好无损，真皮层的胶原蛋白排列整齐，没有明显的水肿。同时，其外围区域很好地整合到周围的天然皮肤组织中，并且观察到许多皮肤附件和毛囊的形成(图3A中的蓝色箭头)。而对照组中仍存在真皮水肿(图3A中的黄色箭头)，没有明显的皮肤附件再生。Western印迹显示在第25天和第31天，实验组中α-SMA表达(357.25±49.82，571.19±62.26)明显高于对照组(211.83±39.38，450.21±35.82，P<0.05)，见图3B。免疫荧光显示，与对照组相比，在第31天，实验组的真皮中α-SMA的表达增加(P<0.05)，见图3C。

A：皮肤组织第31天免疫组化染色(×100);B:Western印迹检测α-SMA表达；C:免疫荧光染色(×100)图3 四黄油通过增加α-SMA表达来增强肉芽形成

2.3四黄油可提高胶原蛋白的合成能力 如图4A所示，与对照组相比，第25天和第31天实验组中胶原Ⅲ蛋白表达明显增加(P<0.05)。如图4B所示，实验组第25天、第31天胶原Ⅲ蛋白表达(592.31±52.10，762.17±55.83)较对照组(319.22±40.10，482.19±35.62)明显增加(P<0.05)。

A：第25天和第31天免疫组化染色(×100)；B：Western印迹检测胶原Ⅲ蛋白表达图4 四黄油可提高胶原蛋白的合成能力

2.4两组肉芽组织微血管密度 免疫组织化学染色显示，两组创面均于烫伤后第3天开始出现新生血管；自第7天起，实验组各时相点创面肉芽组织微血管密度较对照组明显增加(P<0.01)。见表2。

表2 两组烫伤皮肤的肉芽组织微血管密度根/mm2，n=12)

2.5四黄油通过增加VEGF和CD146的水平来增加血管生成 图5A、5B显示，在第14天，实验组VEGF表达(338.15±40.92)较对照组(213.59±33.62)明显增加(P<0.05)。图5C显示，在实验组中观察到大量新形成的血管(白色箭头)。在对照组中，仅发现了少数具有CD146表达的内皮细胞。Western印迹结果(图5D)显示，与对照组相比，实验组(526.19±59.26，827.16±71.58)在第14天和第31天的CD146表达水平较对照组(356.57±42.79，518.23±62.55)更高(P<0.05)。

A：免疫组化染色(×100);B：Western印迹检测VEGF表达；C：免疫荧光(×100)；D：Western印迹检测CD146表达图5 四黄油通过增加VEGF和CD146的水平来增加血管生成

3 讨 论

新生血管化障碍或延迟是糖尿病创面难愈重要原因之一〔14〕。微血管内皮细胞功能异常在糖尿病早期就已经存在，随着血糖升高，多元醇通路、二脂酰甘油(DAG)-蛋白激酶(PK)C通路、蛋白质非酶糖基化、氧化应激及胰岛素抵抗等多种因素相互影响和累加，使微血管内皮细胞损伤逐渐加重，并最终导致糖尿病微血管病变发生。创面愈合的主要决定性因素是创面新生血管化，四黄油促进创面新生血管化的过程对于创面愈合有着重要的影响〔15〕。四黄油具有较好的促进伤口愈合的作用。本研究结果证实四黄油在促进上皮再生和肉芽形成方面的优势。四黄油还通过促进CD146和VEGF的表达来促进血管生成。在糖尿病性溃疡组织中，促炎性细胞因子的表达增加，同时抗炎性细胞因子的表达减少，通常会导致局部溃疡组织中炎症信号的丢失或延迟〔16～18〕。该现象被认为代表了糖尿病溃疡非愈合特性的主要原因之一。新生血管是肉芽组织的重要组成部分，向创伤区域提供营养和运输代谢产物，在创面愈合过程中扮演重要的角色。在正常创面组织愈合过程中，新生的血管可以为炎症反应提供氧和养料，并促进巨噬细胞、角质细胞、血管内皮细胞分泌促血管生长因子以加速创面愈合〔19〕。糖尿病性溃疡是慢性伤口，感染和周围血管疾病的存在使得对这些伤口的治疗要求很高，并且需要多学科的方法〔20〕。本研究表明，四黄油在大鼠烫伤模型中减少了过度的炎症反应。CD146主要表达于新生血管中，可作为检测新生血管的有效指标。本实验发现四黄油具有促进糖尿病创面新生血管再生的作用，通过改善创面的血液供应，促进创面愈合，其机制可能为：①增强创面血管内皮细胞的增殖和迁移能力；②通过趋化浸润创面的炎症细胞分泌促血管生长因子，作用于血管内皮细胞，促进创面新生血管的形成。