利拉鲁肽对糖尿病脑梗死大鼠脑组织胰岛素样生长因子结合蛋白-3及血管生成的影响

卜一 张硕 钱旭东 王红梅 窦志杰

(承德医学院附属医院神经内科，河北 承德 067000)

糖尿病(DM)导致的代谢紊乱可引起大血管、毛细血管病变，是脑梗死的独立危险因素之一；和非DM脑梗死比较，DM脑梗死患者脑组织血管狭窄病变程度更严重，病变支数更多；DM本身影响侧支循环的建立，DM患者血糖水平升高是由单核细胞参与的大血管或毛细血管的形成能力及重塑能力降低〔1〕。利拉鲁肽(LIRA)为胰高血糖素样肽受体激动剂，在DM治疗中被广泛应用，可通过葡萄糖依赖性方式促进胰岛素分泌〔2〕；在正常血糖脑梗死小鼠中有通过促进血管新生而促进脑梗死后神经功能恢复的作用〔3〕。胰岛素样生长因子(IGF)结合蛋白(IGFBP)-3在DM和心血管疾病中的作用越来越受到重视〔4〕，在新生血管形成中也发挥重要作用〔5〕。应芝英等〔6〕研究发现IGFBP-3在急性脑梗死患者血清中表达下降，分析IGFBP-3可能参与急性脑梗死的发病过程。本文以尼莫地平为阳性对照，对LIRA对DM脑梗死大鼠脑组织IGFBP-3及血管形成的影响进行研究，探讨LIRA对DM脑梗死的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及主要试剂 清洁级、健康、体重220～260 g、雌雄各半、SD大鼠购自北京市医疗器械检验所，许可证号：SYXK(京)2015-0005。2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)、电化学发光(ECL)液、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒、聚合酶链反应(PCR)试剂盒、逆转录(RT)试剂盒(美国Bioworld公司)，苏木素、水合氯醛、Trizol(上海碧云天生物技术公司)，兔抗鼠IGFBP-3多克隆抗体、兔抗鼠CD34多克隆抗体、兔抗鼠血管内皮生长因子(VEGF)多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)。

1.2分组与建模 将144只大鼠根据随机数字法分为对照组(C组)、生理盐水组(S组)、利拉鲁肽组(LIRA组)、尼莫地平组(N组)，每组36只。S组、N组和LIRA组建立DM脑梗死大鼠模型：将大鼠腹腔注射链脲佐菌素50 mg/kg，然后给予高脂肪食物喂养，共14 d，测量大鼠随机血糖，连续7 d空腹血糖(FPG)>16.6 mmol/L为DM模型建立成功；水合氯醛麻醉DM模型大鼠，颈正中偏右侧取竖直切口，暴露右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，采用经典的Longa经颈总动脉插入尼龙线栓致大脑中动脉闭塞法〔7〕建立急性脑梗死模型：在颈总动脉分叉处做一小切口，插入尼龙线栓至大脑中动脉起始段，插入深度为18～20 mm，2 h后麻醉大鼠，拔退线栓。C组正常饲料饮食；术中插线深度10 mm，其他步骤同生理盐水组。

1.3神经行为学评分 术后24 h，采用Bederson等〔8〕评分方法对各组进行神经行为学评分。无神经缺损症状为0分，对侧前肢不能伸展为1分，行走向对侧转圈为2分，行走向对侧倾倒为3分，意识受抑制不能行走为4分，死亡为5分。S组、LIRA组和N组神经行为学评分1～3分为建模成功，评分0分、4分及5分者予以剔除，取大鼠按照上述方法建模予以补充。

1.4处理 神经行为学评分结束后，N组给予二甲双胍〔27 mg/(kg·d)，2次/d〕及尼莫地平〔2.16 mg/(kg·d)，2次/d〕灌胃；LIRA组给予二甲双胍〔27 mg/(kg·d)，2次/d〕及LIRA〔0.4 mg/(kg·d)，1次/d〕皮下注射〔9〕；C组和S组皮下注射等量生理盐水。共14 d。治疗后再次进行神经行为学评分，方法同上。

1.5取材 治疗结束后，每组取12只大鼠过量麻醉处理，断头取脑用于TTC染色；每组取12只大鼠深度麻醉后，经心脏灌注生理盐水，然后灌注多聚甲醛，至大鼠四肢微颤、全身僵硬，取出大脑组织，于多聚甲醛中固定，石蜡包埋、切片呈厚4 μm切片用于免疫组化染色；每组取12只剩余大鼠，深度麻醉后冰上断头取脑组织，液氮中保存，用于RT-PCR。

1.6TTC染色 将脑组织冰冻30 min，切成2 mm厚切片，在TTC中孵育15 min(每5 min翻动1次)，红色染色为正常脑组织，白色染色为脑梗死组织，TTC染色后放入多聚甲醛中，过夜浸泡，脑梗死面积采用Image J软件测定，计算脑梗死体积(脑梗死体积比=患侧脑梗死体积/患侧脑半球体积×100%)。

1.7免疫组化染色测定脑组织缺血皮层区IGFBP-3、VEGF表达及CD34+微血管密度 将切片于烤箱中烤2 h，经脱蜡、脱水，加入枸橼酸钠缓冲液进行抗原修复，加入过氧化氢孵育10 min，山羊血清封闭30 min，加入IGFBP-3、VEGF、CD34一抗(稀释比例：1∶200、1∶200、1∶50)过夜孵育，加入生物素标记二抗孵育30 min，C组以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗，加入二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素染色5 min，加入盐酸酒精分化2 s，碳酸锂返蓝30 s，二甲苯透明，中性树胶封片。图像采用Image-Pro Plus软件处理。

1.8Western印迹测定脑组织缺血皮层区IGFBP-3、VEGF蛋白水平 取缺血皮层区脑组织，提取总蛋白质，经凝胶电泳、转膜、封闭后，加入一抗：兔抗鼠IGFBP-3单克隆抗体和兔抗鼠VEGF单克隆抗体，一抗稀释比例1∶300，过夜孵育，加入二抗(1∶5 000)孵育2 h，以β-actin为内参，蛋白条带灰度值用Image J图像分析软件分析。IGFBP-3、VEGF蛋白水平=IGFBP-3、VEGF蛋白条带灰度值/β-actin蛋白条带灰度值。

1.9RT-PCR测定脑组织缺血皮层区IGFBP-3、VEGF mRNA水平 取缺血皮层区脑组织，匀浆，提取脑组织总RNA，逆转录为cDNA，进行PCR扩增，以GAPDH为内参，反应条件为：预反应：95℃ 30 s；PCR：95℃ 10 s、60℃ 30 s，共42个循环。以2-ΔΔCt表示IGFBP-3、VEGF mRNA水平。引物序列IGFBP-3上游引物：5′-AGAGCACAGATACCCAGAAC T-3′,下游：5′-GGTGATTCATGTTGTCTTCCAT T-3′;VEGF上游引物：5′-CGGATCAAACCTCACCAA-3′下游：5′-TCTCCGCTCTGAACGAGG-3′;GAPDH上游引物：5′-CTCTAAGGCTGTGGGCAAGGTCAT-3′下游：5′-GAGA-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.10统计学方法 采用SPSS20.0软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1各组随机血糖和神经评分比较 C组无神经功能缺损，随机血糖正常；与C组比较，S组随机血糖和神经功能评分增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与S组比较，LIRA组和N组随机血糖和神经功能评分下降，差异有统计学意义(P<0.05)，LIRA组和N组随机血糖和神经功能评分差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组随机血糖和神经功能评分比较

2.2各组脑组织TTC染色比较 C组脑组织无白色梗死灶出现，S组脑组织有白色梗死灶出现，脑梗死体积〔(34.25±4.12)%〕；与S组比较，LIRA组〔(12.35±2.57)%〕和N组〔(11.28±2.74)%〕大鼠脑梗死体积均明显减少(t=15.623、16.082，P=0.000)，LIRA组和N组脑梗死体积差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 各组脑组织TTC染色

2.3各组缺血皮层区IGFBP-3和VEGF免疫组化染色 C组缺血皮层区有少量IGFBP-3和VEGF表达，S组缺血皮层区IGFBP-3和VEGF表达增强，LIRA组和N组缺血皮层区IGFBP-3和VEGF表达进一步增强。见图2和图3。各组IGFBP-3和VEGF IOD值比较：C组

图2 各组脑组织IGFBP-3(免疫组化染色，×400)

图3 各组缺血皮层区VEGF(免疫组化染色，×400)

表2 各组缺血皮层区IGFBP-3和VEGF IOD值、微血管密度及脑组织IGFBP-3、VEGF蛋白和mRNA水平比较

2.4各组缺血皮层区微血管密度比较 各组缺血皮层区微血管密度比较：C组

图4 免疫组化测定各组缺血皮层区中CD34+微血管密度(×200)

2.5各组脑组织IGFBP-3、VEGF蛋白及mRNA水平比较 各组脑组织IGFBP-3、VEGF蛋白及mRNA水平比较：C组

图5 Western印迹测定各组脑组织IGFBP-3、VEGF蛋白水平

3 讨 论

LIRA为胰高血糖素样肽受体激动剂，有降糖作用，可通过抑制胰高血糖素分泌、促进胰岛素分泌而发挥降糖作用，在DM治疗中被广泛应用〔10〕；LIRA还可通过血脑屏障，胰高血糖素样肽受体在下丘脑、小脑、海马组织及神经细胞中均有表达，LIRA可通过激活脑组织中胰高血糖素样肽受体减轻炎症反应、抑制细胞凋亡、促进神经元修复等，从而对脑组织发挥保护作用〔11〕。尼莫地平可有效抑制钙离子内流、抑制血管平滑肌收缩、解除血管痉挛，从而改善脑供血，保护神经元，在脑梗死治疗中疗效显著。本研究结果表明LIRA对DM脑梗死有保护作用。

LIRA不仅有降血糖和神经保护作用，在血管新生中也发挥重要作用，如Chen等〔12〕研究发现LIRA可促进小鼠局灶性脑缺血后的血管生成。脑梗死后引起微循环缺血，脑缺血还可引起血管内皮细胞凋亡和功能失调，造成血管壁病变〔13〕。DM患者的高血糖可引起血管新生能力下降，脑梗死后脑缺血局部血氧供应减少也显著降低血管新生能力〔14〕。因此改善DM脑梗死的血管新生能力有重要意义〔15〕。CD34主要在毛细血管网中表达，在大血管内皮中不表达CD34，本研究结果表明LIRA可能通过促进脑组织新生血管生成发挥脑梗死保护作用。分析LIRA可能通过促进DM脑梗死大鼠脑组织血管生成能力减轻脑梗死体积、改善神经功能损伤程度。

IGF信号系统在血管生成方面发挥重要作用，IGFBPs为IGF信号系统的组成部分，与IGF的亲和力比较强，在IGF系统的生物活性调控中有重要作用。IGFBP3和血管形成关系比较密切，在不同疾病中对血管形成的作用不同，在胰腺癌等恶性肿瘤中有抑制血管生成的作用〔16〕；但在类风湿关节炎中有促进血管生成的作用〔17〕。VEGF具有促进血管生成作用〔18，19〕。IGFBP-3和VEGF共同参与多种疾病的发生发展过程〔20〕，下调VEGF可抑制IGFBP-3的表达〔21〕。尼莫地平有促进VEGF表达，改善高血压脑出血患者神经功能的作用〔22〕。本研究结果表明LIRA可能通过促进IGFBP3表达促进DM脑梗死大鼠脑组织新生血管生成。

综上，LIRA对DM脑梗死大鼠有脑保护作用，其疗效与尼莫地平相当，但LIRA在促进脑组织IGFBP3表达和血管新生能力方面优于尼莫地平，LIRA可能通过促进脑组织IGFBP3表达和血管新生能力发挥对DM脑梗死大鼠的脑保护作用。