lncRNA LINC00958靶向调控miR-597-5p对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响

魏娜 侯净 王光辉 王舒 倪青

(贵州省人民医院乳腺外科，贵州 贵阳 550002)

乳腺癌是一种常见的恶性妇科肿瘤，是导致女性癌症相关死亡的主要原因之一〔1〕。迄今为止，在分子水平上乳腺癌的发病机制仍然未知。长链非编码RNA(lncRNA)包含可作为ceRNA的miRNA响应元件，并在各种病理过程中发挥关键作用，包括乳腺癌〔2〕。研究表明，LINC00958在胶质瘤组织和细胞中上调表达，敲低其表达可抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，阻滞细胞周期，LINC00958通过调控miR-203/周期蛋白依赖性激酶(CDK)2在神经胶质瘤的发生中起着致癌基因的作用〔3〕。LINC00958在口腔鳞癌、非小细胞肺癌组织和细胞中高表达，能促进口腔鳞癌细胞的增殖和迁移，抑制细胞凋亡，而下调LINC00958可抑制非小细胞肺癌细胞的增殖，促进细胞凋亡〔4，5〕。miR-597-5p在人乳头瘤病毒(HPV)16阳性子宫颈癌组织中表达下调，可能是HPV16感染后宫颈癌发生的新标志物〔6〕。miR-597在乳腺癌组织中表达下调，上调其表达可抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭〔7〕。但LINC00958在乳腺癌组织中的表达及其对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响，且LINC00958是否通过靶向调控miR-597-5p的表达影响乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡目前尚未可知。因此，本研究对LINC00958和miR-597-5p在乳腺癌组织中的表达和在MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡中的作用进行评价，并分析LINC00958与miR-597-5p之间的靶向关系，旨在阐明LINC00958的功能机制。

1 材料与方法

1.1材料 乳腺癌细胞株MDA-MB-231购自中国科学院细胞研究所(中国上海)；Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、Lipofectamine 2000试剂购自Invitrogen公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自Sigma-Aldrich公司；靶向LINC00958的siRNA(si-LINC00958)和阴性对照(si-NC)、pcDNA-LINC00958和阴性对照(pcDNA)、miR-597-5p模拟物和阴性对照(miR-NC)、miR-597-5p抑制剂(anti-miR-597-5p)和阴性对照(anti-miR-NC)购自RiboBio公司；反转录试剂盒、SYBR Green PCR Master Mix购自TaKaRa公司；Transwell板购自Corning公司；放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解缓冲液、双辛可宁酸蛋白质分析试剂盒购自Applygen公司；TBS-Tween(TBST)购自OriGene公司；二抗购自ProteinTech公司。41对配对的乳腺癌组织与癌旁组织样本来自贵州省人民医院2017年10月至2018年9月接受手术切除的乳腺癌患者，所有样品通过手术获得，并立即将切下的标本浸入液氮中，在-80℃下保存备用。本研究中使用的组织方案通过医院伦理审查委员会批准，患者或其家属知情同意。

1.2细胞培养 MDA-MB-231细胞在10% FBS的DMEM中，37℃，5%CO2的潮湿环境中培养。

1.3细胞转染与分组 转染前，将MDA-MB-231细胞以5×105/孔接种到6孔板。根据制造商的规程，当MDA-MB-231细胞达到70%～80%融合时，使用Lipofectamine 2000试剂将RNA寡核苷酸转染到MDA-MB-231细胞中，分为si-NC组、si-LINC00958组、miR-NC组、miR-597-5p组、pcDNA组、pcDNA-LINC00958组、si-LINC00958+anti-miR-NC组、si-LINC00958+anti-miR-597-5p组。转染48 h，通过qRT-PCR评估siRNA或pcDNA转染的有效性。

1.4qRT-PCR检测LINC00958和miR-597-5p表达 通过使用TRIzol试剂从乳腺癌组织或MDA-MB-231细胞中获得总RNA样品。然后根据反转录试剂盒的指南制备cDNA。对于定量分析，将SYBR Green PCR Master Mix在Step-One Plus实时PCR。比较2-ΔΔCt方法用于计算LINC00958和miR-597-5p相对表达水平。GAPDH或U6被视为内部对照。特异性引物序列如下：LINC00958正向引物5′-GTCTCCCTGGTTTCTCACAGTT-3′，反向5′-TCCCTGGCTACAAATAACCACA-3′；miR-597-5p正向引物5′-ACACTCCAGCTGGGTGTGTCACTCGATGAC-3′，反向5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6正向引物5′-CTC-GCTTCGGCAGCACA-3′，反向5′-AACGCTTCACGA-ATTTGCGT-3′；GAPDH正向引物5′-CTGGGCTACACT-GAGCACC-3′，反向5′-AAGTGGTCGTTGAG-GGCAATG-3′。

1.5MTT检测MDA-MB-231细胞增殖 将转染的1×104个MDA-MB-231细胞接种在96孔板中。48 h时，取100 μl MTT溶液(0.5 mg/ml)加入每个孔中，再孵育4 h后，加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)。在490 nm的波长下读取酶标仪OD值。

1.6Transwell检测MDA-MB-231细胞迁移、侵袭 对于Transwell迁移测定，将无血清DMEM(200 μl)中5×104个MDA-MB-231细胞添加到Transwell的上腔室，而下腔室(600 μl)的DMEM中添加10% FBS。在37℃培养24 h，用棉签除去膜上表面的细胞，室温下用甲醇固定，0.1%的结晶紫将下表面的MDA-MB-231细胞染色20 min。使用TE2000-S倒置光学显微镜从3个独立的样本中捕获3个不同视野的图像，对迁移的细胞数进行定量分析。对于Transwell侵袭测定，上腔室预先涂布40 μl基质胶。后续操作步骤同Transwell迁移测定。

1.7流式细胞术检测MDA-MB-231细胞凋亡 膜联蛋白(Annexin)V-FITC细胞凋亡检测试剂盒用于确定转染的MDA-MB-231细胞凋亡。MDA-MB-231细胞在冰冷的磷酸盐缓冲液(PBS)中洗涤2次，重悬于包含5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶溶液的100 μl结合缓冲液中。在黑暗中孵育，15 min内上FACScan流式细胞仪确定凋亡细胞的比例。

1.8Western印迹检测Ki-67、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达 在RIPA裂解缓冲液中裂解MDA-MB-231细胞，使用二喹啉甲酸蛋白质分析试剂盒对蛋白浓度进行定量，并将每个样品中等量的蛋白(20 μg)加载到10%十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶上，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离并转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。在室温下，用5%脱脂牛奶在TBST中封闭膜1 h，然后在4℃下与一抗(稀释为1∶10 000)孵育过夜。第2天，将PVDF膜用TBST洗涤3次，并与适当的辣根过氧化物酶耦联的免疫球蛋白(Ig)G二抗(稀释为1∶10 000)在室温下放置1 h。通过增强的化学发光试剂盒观察免疫反应带，Image-pro plus进行Western印迹的光密度分析。GAPDH用作负载对照。

1.9双荧光素酶报告实验分析LINC00958与miR-597-5p的靶向关系 使用pGL3-reporter荧光素酶载体构建包含miR-597-5p结合位点的pGL3-LINC00958野生型(WT)或突变型(MUT)载体，分别记为WT-LINC00958或MUT-LINC00958。之后将其分别于miR-NC或miR-597-5p共同转染MDA-MB-231细胞，转染48 h后，用双荧光素酶报告基因测定系统测定WT-LINC00958或MUT-LINC00958的荧光素酶活性。

1.10统计学方法 采用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1LINC00958和miR-597-5p在乳腺癌组织中的表达 与癌旁组织比较，乳腺癌组织中LINC00958表达水平显著升高，miR-597-5p表达水平显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 LINC00958和miR-597-5p在乳腺癌组织中的表达

2.2抑制LINC00958蛋白表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响 与si-NC组比较，si-LINC00958组MDA-MB-231细胞的LINC00958、ki-67蛋白表达水平、细胞增殖均显著降低(P<0.05)。见图1、表2。

图1 Western印迹检测Ki-67蛋白表达

2.3抑制LINC00958表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移、侵袭的影响 与si-NC组比较，si-LINC00958组迁移、侵袭细胞数、MMP-2、MMP-9表达水平均显著降低(P<0.05)。见表2、图2。

表2 抑制LINC00958表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭的影响

2.4抑制LINC00958表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响 与si-NC组比较，si-LINC00958组细胞凋亡率显著增加(P<0.05)，Bcl-2表达水平显著降低(P<0.05)，Bax表达水平显著升高(P<0.05)。见图3、表3。

表3 抑制LINC00958表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响

2.5LINC00958靶向调控miR-597-5p的表达 LncBase Predicted v.2预测出LINC00958与miR-597-5p含有互补的核苷酸序列，见图4。miR-597-5p组比miR-NC组显著降低WT-LINC00958荧光素酶活性(P<0.05)，miR-597-5p组与miR-NC组MUT-LINC00958荧光素酶活性无显著变化(P>0.05)，见表4。pcDNA-LINC00958组miR-597-5p表达水平(0.42±0.04)显著低于pcDNA组(1.00±0.05，P<0.05)，si-LINC00958组miR-597-5p表达水平(3.07±0.28)显著高于si-NC组(1.03±0.07，P<0.05)。

图4 LINC00958的序列中含有与miR-597-5p互补的核苷酸序列

表4 双荧光素酶报告实验

2.6miR-597-5p过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响 与miR-NC组比较，miR-597-5p组MDA-MB-231细胞的miR-597-5p表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)，细胞增殖降低，差异有统计学意义(P<0.05)，迁移、侵袭细胞数显著减少(P<0.05)，凋亡率显著增加(P<0.05)，Ki-67、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表达水平显著降低(P<0.05)，Bax表达水平显著升高(P<0.05)。见图5、表5、图6。

图5 增殖、迁移侵袭和凋亡相关蛋白表达

表5 miR-597-5p过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响

图6 miR-597-5p过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移、侵袭和凋亡的影响(结晶紫染色，×400)及细胞凋亡流式图

2.7干扰miR-597-5p表达逆转了抑制LINC00958表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的作用 与si-LINC00958+anti-miR-NC组比较，si-LINC00958+anti-miR-597-5p组MDA-MB-231细胞的miR-597-5p表达水平显著降低(P<0.05)，细胞增殖显著升高(P<0.05)，迁移、侵袭细胞数显著增加(P<0.05)，凋亡率显著减少(P<0.05)，Ki-67、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表达水平显著升高(P<0.05)，Bax表达水平显著降低(P<0.05)。见表6、图7、图8。

表6 干扰miR-597-5p表达逆转了抑制LINC00958表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的作用

图7 干扰miR-597-5p表达逆转了抑制LINC00958表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移、侵袭和凋亡的作用(结晶紫染色，×400)及细胞凋亡流式图

1～2：si-LINC00958+anti-miR-NC组，si-LINC00958+anti-miR-597-5p组图8 增殖、迁移侵袭和凋亡相关蛋白表达

3 讨 论

缺乏特异性的诊断和预后生物标志物可能导致乳腺癌患者的低生存率。研究表明，lncRNA在许多生物学过程中都起重要作用，而ceRNA活性与癌症的发展密切相关〔8〕。lncRNA的频繁失调与许多细胞过程和肿瘤的发病机制有关。从机制上讲，lncRNA的异常表达通过调节转录、多个靶标和途径而参与癌细胞的功能紊乱和许多分子过程，从而引起肿瘤的发生〔9〕。有学者提出LINC00958是与多种癌症的发生和发展有关的致癌lncRNA〔10，11〕。LINC00958在头颈部鳞状细胞癌组织和细胞系中表达上调，其上调与肿瘤分化，晚期肿瘤分期和患者总体生存期缩短有关。在体外，LINC00958表达诱导头颈部鳞状细胞癌细胞活力和集落形成〔12〕。LINC00958在子宫颈癌组织和细胞中升高，LINC00958通过负调节miR-625-5p的表达，促进子宫颈癌细胞增殖和转移〔13〕。LINC00958在鼻咽癌组织标本和细胞系中上调，LINC00958过表达与鼻咽癌患者的肿瘤大小、淋巴结状态、TNM分期和较差的总体生存率显著相关。而LINC00958下调抑制了鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭，并在体外诱导了细胞凋亡〔14〕。由此可见，LINC00958在多种癌症中起着癌基因的作用。本研究结果提示LINC00958在乳腺癌中同样作为致癌lncRNA，在乳腺癌MDA-MB-231细胞恶性表型中发挥关键作用。

miRNA异常表达参与了人类恶性肿瘤的发生，进展、转移和耐药性，已经成为乳腺肿瘤中基因表达的重要调节剂〔15〕。研究〔16，17〕报道miR-597-5p在结直肠癌、胰腺癌组织和细胞中表达下调，研究〔16〕显示，miR-597-5p可抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭。miR-597-5p可以减弱胰腺癌细胞的活力、菌落形成、侵袭，并降低Ki67、Bcl-2的表达，同时增加了胰腺癌细胞的凋亡及Bax的表达〔17〕。本研究结果表明，miR-597-5p过表达使乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭能力显著降低，细胞凋亡则显著升高，并且Ki-67、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表达被抑制，Bax表达被促进，与前人研究〔17〕相吻合。

研究证实，lncRNA可以充当ceRNA，竞争性地靶向miRNA并调节miRNA的功能〔18，19〕。类似的，胰腺癌中的LINC00958可以作为ceRNA竞争性结合miR-330-5p〔20〕。LINC00958可与miR-5095结合通过核糖核苷酸还的酶亚单位(RR)M2来调节宫颈癌对放射疗法的细胞敏感性〔21〕。LINC00958通过靶向miR-378a-3p上调类胰岛素生长因子(IGF)1R促进膀胱癌细胞的增殖和转移〔22〕。本研究结果证实LINC00958可以靶向结合miR-597-5p并调节miR-597-5p的功能。在功能上，LINC00958上调降低miR-597-5p的水平，LINC00958下调提高miR-597-5p的水平。干扰miR-597-5p表达后，抑制LINC00958表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的作用被逆转。可见LINC00958通过miR-597-5p调节了乳腺癌的发展。

综上，LINC00958在乳腺癌组织中表达上调，抑制LINC00958表达可抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖，迁移和侵袭，同时诱导凋亡，机制与靶向miR-597-5p有关。LINC00958对miR-597-5p的调控可能是乳腺癌中新的致癌调控机制。LINC00958和miR-597-5p可能成为用于预防乳腺癌患者的肿瘤进展和转移的候选治疗靶标。