2021 年广东省猪流行性腹泻病毒分子监测和部分S 基因序列分析

陈胜男，胡柱祺，林金森，邵洋洋，钟汝情，张杰，谢莹，焦思思，欧阳慧敏，卢嘉贤，许伟锋，邹育根，张建峰，翟少伦

（1.广州中科基因检测服务有限公司 广州 510500；2.广州市花都区动物卫生监督所 广州 510800；3.广东省农业科学院动物卫生研究所猪病研究室/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站 广州 510640）

1 背景

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起猪的一种急性接触性消化道传染病，其主要特征为腹泻、呕吐和快速消瘦。各种年龄的猪都易感，哺乳仔猪、架子猪及育肥猪的感染率可达100%，以哺乳仔猪受害最严重，母猪发病率也较高。

1971 年在英国首次报道了PED。此后，许多国家均有本病的报道，如比利时、德国、加拿大、匈牙利、法国、日本、保加利亚等（图1）。我国从80 年代初开始陆续有PED 的发生，并分离到病毒，2010 年以来，在包括中国在内的主要养猪国家暴发和流行，成为最重要的猪病毒性腹泻病之一。

图1 猪流行性腹泻的流行与变异

广东作为养猪大省、猪肉消费大省，开展猪流行性腹泻病毒的分子流行病学调查具有重要意义和实用价值，主要体现在：①可以鉴定病原的血清型；②可以研究其分子特征；③可以分析其遗传变异规律，根据流行毒株流行趋势，制备或选用合适的疫苗进行防控。因此，本研究对广东省16 个地市的代表性大、中、小规模猪场进行调查、采样、病原测序分析研究，获取科学数据，提出了腹泻的防控措施建议，以供防控决策参考。

2 材料方法

2.1 监测地区及对象

共采集广东省16 个地市62 个规模猪场的379 份样品（图2），其中茂名地区9 个规模猪场共计56 份样品，江门地区8 个规模猪场共计48 份，惠州地区6 个规模猪场共计45 份，湛江地区8个规模猪场共计42 份，广州地区4 个规模猪场共计41 份，清远地区4 个规模猪场共计38 份，河源地区7 个规模猪场共计32 份，肇庆地区6 个规模猪场共计29 份，佛山地区5 个规模猪场共计25份，梅州地区5 个规模猪场共计23 份，潮州地区3 个规模猪场共计15 份，阳江地区6 个规模猪场共计14 份，韶关地区2 个规模猪场共计11 份，揭阳地区1 个规模猪场共计10 份，珠海地区1 个规模猪场共计6 份，中山地区1 个规模猪场共计5 份。

图2 2021 年广东省猪流行性腹泻病毒抗原监测区域

2.2 检测方法

采用猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒三重PCR 检测方法对临床样品进行检测，具体引物序列见表1，具体反应条件为：42℃反转录45min，94℃预变性5min；94℃变性50s，56℃退 火60s，72℃延 伸60s（35个循环）；72℃再延伸10min。

表1 猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒三重PCR检测方法用引物

此外，对猪流行性腹泻病毒阳性的样品开展其部分S 基因扩增，具体扩增引物为：PEDV-919-F：5'-GAACTGCCATTCAGCGTATT-3'，PEDV-919-R：5'-CTGCCAGATTTACAGACACCTA-3'，扩增条件为：42℃反转录30min，94℃预变性5min；94℃变性40s，56℃退火30s，72℃延伸30s（35个循环）；72℃再延伸10min。扩增目的条带大小为919bp。

3 结果与分析

3.1 广东省各地市猪流行性腹泻病毒抗原流行分布情况

对采集的379 份腹泻样品，使用猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒三重PCR 检测方法，检出猪轮状病毒核酸阳性样品106 份，阳性率27.96%；检出猪流行性腹泻病毒核酸阳性样品50 份，阳性率13.19%（表2）；未检出猪传染性胃肠炎病毒核酸阳性样品。

表2 猪流行性腹泻病毒检测结果

3.2 PEDV 部分S 基因的序列分析

利用RT-PCR 方法对PEDV 阳性样品进行了部分S 基因扩增、测序，并使用DNASTAR 软件与来自我国、比利时、韩国等国的9株参考毒株进行比较分析，确定了各个毒株之间的亲缘关系，并绘制了系统发育树。结果表明：8 个毒株（红色框区域）的部分S 基因片段长约900bp（图3），与经典疫苗株CV777 和DR13 的同源性分别为96.1%～97.1%和95.7%～96.8%，与疫苗株AJ1102、LW、ZJ08 的同源性分别为93.1%～98.1%，93.1%～98.1%和92.5%～96.8%，而与流行株SDFQ、SDSJ、SXZJ、JXTQ 的同源性为97.1%～99.9%（图4）。遗传进化树分为2 个进化分支，即G1 基因型和G2基因型（图5）。G1 主要为PEDV 疫苗株，G2 大多数为PEDV 流行毒株，这说明G2 是广东省PEDV 流行的主要基因型。

图3 普通RT-PCR 扩增部分S 基因电泳结果

图4 PEDV S 基因的同源性分析

图5 PEDV S 基因遗传进化分析

4 小结与展望

2010 年以来，猪流行性腹泻在我国再次暴发，是造成我国各地养殖场仔猪死亡的主要疫病之一，严重地危害养殖业的发展和养殖户的经济利益。因此，每年开展对PED 的流行病学监测和免疫预防，特别是通过分子生物学手段对PEDV 的分子流行病学特征进行监测，可使我们了解PEDV 毒株的来源和变异程度及毒株之间的亲缘关系，从而为该病的防控提供理论依据。

由于PEDV 流行的毒株为G2 基因亚群。PEDV 流行毒株与疫苗毒株CV777 在S 基因有很大的变异。因此，猪场的流行性腹泻防控难度加大，接种PEDV 弱毒疫苗与灭活疫苗的猪场防控效果不理想。但希望疫苗企业可以根据流行趋势研制新流行毒株疫苗或养殖场选用合适的疫苗进行防控。此外，猪场做好饲养管理、生物安全、对症治疗也很关键，可减少疫病的流行及减少经济损失。