常见猪病毒性疾病及其检测方法研究进展

洪亮，王福云，卢敏，卢启寰

（1.台州市药品检验研究院 浙江台州 318000；2.浙江丰安生物制药有限公司 浙江台州 318000）

随着养殖技术的进步以及国内对猪肉需求量的不断增加，我国的猪养殖业越来越向规模化的方向发展，甚至在部分地区，猪养殖业已经成为当地重要的经济来源。猪疾病问题在猪养殖过程中给养殖带来的不利影响较大，疫苗免疫接种不恰当、引种不合理、圈舍卫生环境较差、养殖密度过大、猪群之间接触频繁、缺乏有效的防疫手段等因素都会导致猪相关疫病的传播，从而影响养殖效益。猪疾病根据感染源的区别，可以分为寄生虫疾病、细菌性疾病以及病毒性疾病。虽然寄生虫感染一般不会直接致病，但寄生虫在体内或体表繁殖生长过程中会与猪争夺营养，从而导致猪群抵抗力下降，进而继发感染多种细菌性或病毒性疾病。猪细菌性疾病目前有抗生素相关药物可以进行治疗，但病毒性疾病尚无特效药。尽管针对某些猪病毒性疾病，已研发出相应的疫苗，但由于病毒的变异性较强，即使有疫苗也无法100%起到保障作用，况且部分疫病还暂无相应疫苗。因此，对各种猪病毒性疾病的及早诊断尤为重要。其中常见的诊断方法包括传统病原学检测、免疫学检测及分子生物学检测。本文详细介绍了常见猪病毒性疾病的特点，进而对现有猪病毒性疾病检测方法的技术特征进行了比较，以期为检测方法的研发和应用提供参考。

1 猪病毒性疾病

猪病毒性疾病通常是由一、二、三类动物疫病组成，由多种病毒感染引发的一类病毒性传染性疾病的总称，是生猪养殖中威胁较为严重的一类。目前我国的生猪养殖规模不断增长，新型病毒性传染疾病的发生率逐年升高。2018 年下半年，以非洲猪瘟为首的病毒性疾病席卷全国，对生猪养殖业造成毁灭性打击。常见的猪病毒性疾病主要包括猪口蹄疫、猪瘟和猪流行性腹泻等。

1.1 猪口蹄疫

口蹄疫为农业农村部《一、二、三类动物疫病病种名录》中的一类动物疫病，是世界范围内危害和造成经济损失最大的病原体之一。世界动物卫生组织（WOAH）把口蹄疫列为A 类传染病之首，它是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种急烈性传染疾病，主要感染偶蹄类动物，如猪、羊、牛等。口蹄疫病毒分类上是属于微RNA 病毒科口蹄疫病毒属。病毒球形，直径约为23nm 左右，单股RNA，没有囊膜，有较强的对外界环境抵抗力，在组织和污染物中甚至能存活数月时间，对紫外线、高温、酸碱敏感，但酚、酒精、氯仿等消毒剂对口蹄疫病毒无效。动物感染口蹄疫后主要表现为发热以及跛行，并且在其口腔、蹄、乳房等部位的黏膜或皮肤会出现水泡、溃烂等现象。而患病的幼畜则会出现出血性肠炎和坏死性心肌炎，从而导致急性死亡。

1.2 猪瘟

由经典猪瘟病毒（CSFV）引起的高度接触性传染疾病一般称为猪瘟，特点是具有高传染性和高致病性。经典猪瘟病毒属黄病毒科瘟病毒属，为单股正链RNA，其中间部分具有编码多聚蛋白的开放阅读框。猪瘟被WOAH 列为必须通报的疫病，也是我国的一类动物传染病。猪瘟的出现距今已有200 多年历史，虽然目前不少国家鲜有猪瘟发病的报道，但在近期日本又出现猪瘟的暴发流行，所以仍应重视其对养猪业发展的危害。

1.3 非洲猪瘟

由非洲猪瘟病毒（ASFV）感染家猪及各种野猪引起的一种具有急性、出血性、以及烈性传染性的疾病被称为非洲猪瘟。非洲猪瘟病毒属于非洲猪瘟科非洲猪瘟病毒属，为双股线状DNA，大小一般为170～190kb。该病被WOAH 列为法定通报的动物疫病，也是我国的一类动物疫病。自2018 年8 月传入我国辽宁省以来，我国共发生非洲猪瘟疫情近150 起，扑杀生猪110 多万头，给我国生猪养殖业造成了巨大的损失。非洲猪瘟发病过程短，急性感染死亡率较高，患畜的临床表现为心跳加快，呼吸困难以及超过40℃的高热，还会出现咳嗽，皮肤发绀，眼或鼻有浆液性、黏液性的脓性分泌物，淋巴结、肾及胃肠黏膜伴有明显的出血等症状。因为非洲猪瘟和经典猪瘟在症状上极为相似，除了通过专业实验室检测外，一般很难准确区分二者。

1.4 猪繁殖与呼吸障碍综合征

由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）引起的猪传染性疾病一般称为猪繁殖和呼吸障碍综合征，民间又称其为“猪蓝耳病”。猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒属于尼多病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属，单股正链RNA，具有囊膜。猪繁殖与呼吸障碍综合征以妊娠母猪流产、产死胎、产木乃伊胎等繁殖障碍和以仔猪为代表的各年龄段猪的呼吸道疾病为特征。该病曾经在世界各地上演过空前的“流产风暴”，造成巨大的经济损失。猪繁殖与呼吸障碍综合征不仅会造成母猪大量的流产，同时会使猪群发生严重免疫抑制，导致猪其它细菌性或病毒性疫病的产生，从而产生巨大的防控压力，已成为困扰我国规模化养猪的主要疫病之一。

1.5 猪伪狂犬病

由伪狂犬病毒（PRV）引起的多种动物均能感染的高度接触性、急性传染性疾病一般称为伪狂犬病。伪狂犬病毒属于疱疹病毒科水痘病毒属，双链线性DNA，具有圆形或椭圆形的外观，对外界抵抗力较强，病料腐败11d 后才会逐渐失去感染能力。猪是伪狂犬病毒唯一的自然宿主，因此该病严重危害到我国的生猪养殖业。

1.6 猪乙型脑炎

猪乙脑在农业农村部《一、二、三类动物疫病病种名录》中被列为二类动物疫病，属于严重危害中枢神经系统的自然源性的人猪共患急性传染病。乙脑病毒（JEV）属黄病毒科黄病毒属。病毒颗粒呈球型，直径约为50nm，基因组为单股正链RNA，有传染性。20面体对称，有衣壳。作为自然疫源性的疫病，乙型脑炎在感染各类动物后都可能使其成为本病的传染源，而其中猪的感染最为普遍，猪感染后主要产生高热、流产、死胎和公猪睾丸炎等症状。乙型脑炎的重症病死率高，且易造成不同程度的神经系统后遗症，故世界卫生组织（WHO）将其列为重点控制的传染病。

1.7 猪圆环病毒病

生猪感染猪圆环病毒（PCV）而引发的一类病毒性传染病被称为猪圆环病毒病。猪圆环病毒是目前世界上发现的最小的一种病毒，其直径仅为17nm。猪圆环病毒目前分为三型，其中PCV1 为非致病性类型；PCV2 为致病性类型，会引起断奶仔猪的多系统衰竭综合征，感染严重时其造成的病死率甚至可高达40%；PCV3 是近些年才发现的一种新类型。猪圆环病毒病具有一定的潜伏期，所以在前期不容易被发现，感染后期断奶仔猪引发的多系统衰竭综合征不仅会造成高致死率，同时会引起仔猪机体抵抗力降低，导致继发或混合感染，进一步提高了诊治的难度，该病严重影响我国生猪养殖业的发展。

1.8 猪流行性腹泻

由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的猪急性高度接触性肠道传染性疾病被称为猪流行性腹泻，其症状主要为水样腹泻、呕吐、脱水等。猪流行性腹泻病毒为冠状病毒科冠状病毒属，为单股正链RNA，具有囊膜。该病近些年来在世界各国都出现过大规模暴发流行的情况，使生猪养殖业遭受巨大的经济损失。

2 常见猪病毒性疾病检测方法

2.1 传统病原学检测

传统病原学检测包括电镜检测（EM）、病毒分离培养鉴定等方法。镜检是快速检测病毒的方法之一，是指在电镜下对病毒进行检测，常用磷钨酸进行负染色，不仅能直接观察及检测病毒的形态与结构，也能鉴定病毒。病毒分离培养鉴定则依据病毒只能在活细胞内复制增殖，选择敏感动物、鸡胚或离体组织与细胞，分别进行动物接种、鸡胚接种、组织培养或细胞培养来分离培养病毒。培养后的纯病毒可用于鉴定、分型、感染特性和致病特性等研究。传统方法虽具有技术成熟的优势，但也有其固有的局限性，比如检测时间长、操作繁琐、很依赖检验人员的经验、往往需要培养活病毒才能检测等缺点。

2.2 免疫学检测

常见免疫学检测技术包括酶联免疫吸附法（ELISA）和胶体金免疫技术。

1）酶联免疫吸附法（ELISA）。酶联免疫吸附法的基础是抗体（抗原）的固相化及抗体（抗原）的酶标记，基本原理是将一定浓度的抗体（抗原）吸附在固相载体（最常见的为聚苯乙烯）的外表面，且要维持抗体（抗原）的免疫活性，并通过共价键形成酶标抗体（抗原）；样本（抗原或抗体）加入后，与固定板上的酶标抗体（抗原）结合形成酶标复合物，可依据酶标复合物显色的深浅来判断是否发生了免疫反应以及相应抗体（抗原）的量的多少，以此来进行定性或定量的分析。文献采用抗猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的N 蛋白单克隆抗体来建立检测PRRSV 抗体竞争性的酶联免疫吸附法，该方法具有高敏感性和高特异性，与IDEXX 的PRRSV ELISA 的检测结果符合率>90%；文献以口蹄疫病毒VP1 重组结构蛋白为抗原建立猪口蹄疫病毒抗体的间接酶联免疫吸附检测法，与液相阻断ELISA 的检测结果符合率为96.25%，与HA 的检测结果符合率为96.2%，与上海优耐特FMDV VP1 ELISA 检测结果符合率为87.27%；文献以乙型脑炎病毒弱毒疫苗株作为诊断抗原来建立猪乙脑病毒血清抗体间接酶联免疫吸附检测法，研究者将其对相关地区的猪乙型脑炎血清抗体进行检测，和市售的试剂盒比较，结果符合率为95.6%，与以NS1 蛋白包被建立的酶联免疫吸附检测法比较，结果符合率为97.7%。

2）胶体金免疫技术。胶体金是氯金酸在还原剂的作用下，聚合成带负电的稳定的疏水金颗粒胶溶液，金颗粒表面的负电荷，能够和多种生物高分子物质的正电荷基团因静电吸附作用而牢固结合，这种结合不会影响其生物特性，因此被视为免疫反应的理想标记物。胶体金标记技术以胶体金作为示踪标志物，用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术，主要包括斑点免疫金渗滤法（dot immunogold filtration assay，DIGFA）和胶体金免疫层析法（immunochromatographic test strip，ICST）。文献选择致病性猪圆环病毒的Cap 蛋白，建立了致病性猪圆环病毒的胶体金免疫层析检测法，与市售ELISA 试剂盒比较，对相关血样的检测结果符合率达到94%。文献建立了O 型口蹄疫病毒的胶体金免疫层析检测法，可在5min 内完成检测，并与其它病毒抗体无交叉反应，灵敏度为95%，与市售ELISA 试剂盒的检测效率相当。文献则建立了基于N 蛋白的PRRSV 胶体金免疫层析检测法，灵敏度为97.5%，特异性为91.1%，与市售ELISA 试剂盒的检测效率相当。文献建立了基于CnC2 蛋白的CSFV 胶体金免疫层析检测法，灵敏度为97%，特异性为100%，与市售试剂盒的检测效率相当。文献研发了一种PRV 荧光免疫层析检测试纸条（F-ICS），最低检测限度为0.13ng/mL，检测线范围（DLR）为0.13～2.132 ng/mL，最低检测限比普通的试纸条还低10 倍，与PCR 的检测结果一致。

免疫学检测技术在猪疫病检测中应用广泛，其具有快捷简便，结果直观，安全无污染，经济实惠等优点；但每次仅能检测单样本，通量低，且无法进行定量检测，其灵敏度、特异性亟待加强以满足市场的高要求。

2.3 分子生物学检测

常见分子生物学检测方法有荧光定量PCR（qPCR）技术、多重PCR 技术、恒温扩增技术、基因芯片技术等。

1）荧光定量PCR（qPCR）技术。荧光定量PCR 是通过荧光染料或者荧光标记的探针，在整个PCR 过程中标记跟踪PCR 产物，最终实现定量分析模板的方法。由于其定量准确、灵敏度及特异性高等优点，被广泛应用于多种猪病毒的鉴别诊断，是目前最常用的诊断方式。

2）多重PCR 技术。多重PCR 是将多对引物加入到同一个PCR体系中，同时扩增出多个核酸片段的方法，因而广泛应用于多种病原微生物的同时检测。文献针对TGEV 的N 基因、PEDV 的M 基因、猪A 群轮状病毒的VP7 基因设计了特异性引物，成功建立了可以同时检测PEDV、TGEV 和猪A 群轮状病毒的多重RT-PCR 方法；文献建立的EvaGreen 多重实时荧光PCR 体系可同时检测包含猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒II 型（PCV2）、猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、日本脑炎病毒（JEV）、伪狂犬病病毒（PRV）在内的6 种常见猪病毒，结果显示6 种猪病毒在EvaGreen 多重实时荧光PCR 中均无非特异性扩增且灵敏度可达100～500copies/μ L；且批内和批间重复的Tm 变异系数均在5%以内。

3）恒温扩增技术。环介导恒温扩增技术（LAMP）是一种本世纪兴起的新型核酸扩增方法，被广泛应用于多种病毒的检测。该法具有快速简便、高灵敏度、高特异性等特点，被基层单位大量使用。文献建立了PEDV 的LAMP 检测法，该法在62℃水浴40min 即可完成实验，结果显示该法可检测的RNA 量可低至10pg，且不会发生其它常见猪病毒核酸的扩增反应，特异性较好。文献利用LAMP 原理建立了一个快速且能定量的Real-time RT-LAMP 法，通过扩增JEV 的包膜E 蛋白基因来定量检测JEV，将检测时间缩短至1h，检测下限为1PFU，其敏感性与常规RT-PCR 相似。文献建立了PRRSV 的环介导逆转录等温检测方法，该方法灵敏度比荧光定量PCR 高100 倍，全部反应可在1h 内完成，且PCV、CSFV、PRV 的扩增结果均为阴性。

重组酶介导等温扩增技术（recombinase aided amplification，RAA）是新兴的已申请我国专利的一种等温检测方法，其利用重组酶、单链结合蛋白、DNA 聚合酶在37℃等温条件下（最适温度）进行核酸扩增的一种技术。文献基于非洲猪瘟病毒保守基因B646L（P72）序列，设计特异性引物、探针，建立ASFV RAA-重组酶介导等温核酸扩增检测法，检测时间仅需10min，且与口蹄疫病毒（FMDV）、伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）等均无交叉反应，与WOAH 推荐的荧光定量PCR 检测结果一致。

4）基因芯片技术。基因芯片技术是利用核酸分子杂交配对的特性建立起来的一种高效、特异、灵敏、快速的基因分析技术，可在一个芯片中实现数个样品、多种病原体的同时检测。把PCR 扩增技术和基因芯片检测技术相结合，通过PCR 的扩增作用及基因芯片的杂交技术，实现两者的优势互补，从而达到较高的灵敏度。文献利用基因芯片技术和多重PCR 技术建立了同时检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、乙脑病毒及猪圆环病毒2 型这5 种病毒，该方法特异性强、稳定性好，灵敏度可达10copies/μL。文献建立了可同步检测10 种猪常见疫病病毒（PRRSV、PRV、CSFV、PCV2、SIV、PEDV、TGEV、PPV、FMDV 和PCMV）的基因芯片检测技术，应用其对1,006 份样品进行符合检测，结果显示，该方法快速便捷、灵敏度高、特异性好，最低检测限可达105copies/μL，与普通PCR/RT-PCR 的检测符合率达到96.76%以上。

3 展望

虽然目前我国在控制猪疾病方面有了很大的发展，但仍不断有新的病毒性疾病出现，从而严重危害生猪养殖业。针对猪病毒性疾病的快速、准确诊断就显得尤为重要，其中分子生物学检测以其快速、准确、简便等优势越来越成为最常见的检测手段。而多重检测则可同时检测多种病毒从而可更好地防控病毒性疾病，降低猪发病率，保障养猪业从业者的利益，降低因病毒的传播导致的损失。

随着生物检测技术的不断革新，笔者推测，未来猪病毒性疾病的诊断技术会逐步往微型化、集成化及大数据分析的方向发展，可为我国猪养殖行业提供更好的技术支撑，促进该行业又好又快的发展，进一步夯实全社会食品安全基础。